Exposição a tóxicos ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento, com efeitos a longo prazo. Protocolos detalhados são fornecidos para ilustrar uma estratégia usando um modelo eficaz de laboratório para estudar o efeito da exposição embrionária precoce ao Bisfenol A. Nós fornecemos a fecundidade e ensaios comportamentais para monitorar a eficácia da nossas bio-ensaios de exposição tóxica.
Bisfenóis, tais como o bisfenol A (BPA) e Bisfenol S (BPS) são polimerização agentes amplamente utilizados na produção de plásticos e inúmeros produtos de uso diário. Com base na sua estrutura química e propriedades biológicas como estradiol, eles foram classificados como endócrinos compostos (EDC). A exposição prolongada a CDE, mesmo em doses baixas, tem sido associada a vários defeitos de saúde, incluindo câncer, distúrbios comportamentais e infertilidade, com maior vulnerabilidade indicada durante os períodos do desenvolvimento precoce. Estudos celulares e moleculares com o geneticamente tractable modelo nemátode Caenorhabditis elegans têm demonstrado que a exposição ao BPA provoca apoptose, letalidade embrionária e perturbação no DNA mecanismos de reparação. Informamos anteriormente que a exposição dos embriões de c. elegans de baixas doses de fecundidade diminui de bisfenóis diferentes. Além disso, mostramos que os efeitos da exposição durante a fase inicial de desenvolvimento persistirem na vida adulta como analisada quantificando o comportamento de habituação, uma forma de aprendizagem não associativa. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para exposição embrionária a CDE baixa dose anterior e a fecundidade associada toque ensaios de habituação, juntamente com resultados representativos.
Exposição a tóxicos ambientais, particularmente os compostos aqueles que tendem a interferir com o desenvolvimento, tem estado sob escrutínio científico cuidadoso nos últimos anos. Mais de mil produtos químicos de uso diário são classificados como endócrinos compostos (EDC)1. Períodos de rápido crescimento e desenvolvimento, que incluem embrionárias, infantil e fases de infância, eram conhecidos por ser particularmente vulneráveis aos efeitos deletérios que mesmo baixas doses EDC. Seus efeitos foram mostrados para causar reprodutivo e neurológico transtornos2. A orientações painel nos agência de proteção ambiental e nos programa nacional de toxicologia, uma dose baixa pode ser definida como qualquer dose abaixo do nível do que foi relatado para causar uma mudança biológica observável ou danificar a3. Além dos efeitos de doses baixas de CDE individuais, misturas de vários CDE encontrado em baixas concentrações no ambiente têm o potencial de causar efeitos cumulativos substantivas4.
Bisphenol A (BPA ou 4,4′-(propane-2,2-diyl)) é um agente de polimerização encontrado em itens comumente usados como garrafas de água, armazenamento de recibos, selantes dentários e os forros de bebida e comida latas5. Devido à sua semelhança estrutural com 17 β Estradiol (E2) e a sua afinidade para os receptores de estrogênio ERα e ERβ, BPA foi classificado como um produto químico (EDC)5,6endócrinos. Apesar de mais fraco, afinidade do BPA para receptores de estrogênio mostrou que afetam o sistema de reprodução de ambos os sexos e interromper funções neurais em doses que são considerados seguros7,8. Foram observadas alterações na metilação do DNA, através de mecanismos epigenetically regulamentados para causar defeitos neuronais a longo prazo em ratos expostos ao BPA9. Especificamente, o BPA também tem sido implicado como um possível culpado para o aumento das taxas de hiperatividade, deficiência de atenção e aumento da sensibilidade às drogas devido ao aumento de visto em receptores de dopamina D1 do posencéfalo límbica do rato após exposição crônica 9 , 10. evidência significativa sobre os efeitos deletérios da CDE sobre a saúde humana é baseada em estudos de correlação, concentrando-se principalmente na exposição crônica das populações a tóxicos ambientais, mesmo em doses baixas,5; no entanto, limitações em inferências de estudos humanos e na manipulação de controles experimentais foram aceites ao se lidar com as críticas de campanha publicitária sem fundamento11,12.
Devido à conservação dos genes Caenorhabditis elegans’ em relação dos mamíferos, incluindo seus genes do hormônio esteroide-receptor, os pesquisadores utilizaram este modelo de laboratório geneticamente tractable para desvendar os efeitos funcionais e mecanicistas da CDE 13. experimentos com c. elegans mostraram que estes compostos tais como o BPA e BPS podem causar apoptose, mortalidade embrionária, ruptura nos mecanismos de reparação da quebra de DNA dupla-hélice e função neural14,15 ,16.
Nosso laboratório tem mostrado anteriormente que nem baixa dose exposição limitada a embriogênese precoce leva a fecundidade baixou com défices comportamentais nos sobreviventes adultos15. Habituação a um estímulo repetido é uma forma de aprendizagem não associativa em sistemas modelo, incluindo c. elegans, e nossa metodologia usa esta forma de aprendizagem não-associativa como uma saída comportamental a ensaiar os efeitos a longo prazo da exposição embrionária para as substâncias tóxicas17 especificamente, nós fornecemos protocolos detalhados para estudar a exposição BPA em c. elegans, incluindo seus efeitos imediatos sobre mortalidade embrionária e efeitos a longo prazo sobre o comportamento do adulto, com uma esquema geral retratada em Figura 1. Resultados representativos de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa são fornecidos para realçar a eficácia de nossa metodologia.
Fases de rápido crescimento e desenvolvimento como embriogênese são particularmente vulneráveis aos efeitos prejudiciais de vários compostos endócrinos, incluindo o BPA. Nós fornecemos protocolos detalhados para estudar os efeitos da exposição ao BPA ou outras substâncias tóxicas no modelo de invertebrados c. elegans , que permite a titulação conveniente de uma gama de concentrações, para avaliar seu efeito sobre a viabilidade do embrião (Figura 2) . Acompanhar experimentos comportamentais sobreviventes adultos que se desenvolvem de embriões que foram expostas a baixas doses de BPA permitem a análise do efeitos a longo prazo na função neuronal (Figura 3). A ideia central deste trabalho é fornecer protocolos detalhados para expor os embriões a várias substâncias tóxicas durante o período de embriogênese inicial no modelo de c. elegans ; a primeira janela de 4 h de seu período de desenvolvimento embrionário de 11,5 horas (a 20 ° C) corresponde ao período de proliferação, que é seguido por organogênese. Nesse sentido, nós fornecemos a validação dos pontos de extremidade através de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa. Enquanto a base mecanicista da ação do BPA e outros bisfenóis é o Santo Graal para que destina-se a investigação neste campo, temos não uma tentativa de oferecer uma explicação mecanicista para a ação do BPA neste artigo focado de metodologia. No entanto, gostaríamos de salientar que o modelo de c. elegans oferece um sistema ideal para dissecar ainda mais o mecanismo de ação. Por exemplo, em um futuro trabalho para decifrar os mecanismos de ação do BPA, c. elegans mutantes podem ser gerados e projectado para uma resistência aos efeitos do BPA e, assim, pavimentar o caminho para decifrar o caminho. Além disso, o nosso papel de companheiro lida com o efeito do BPA no nível de sincronia da rede neural em vertebrados, fornecendo uma outra avenida para entender a base para investigar potenciais mecanismos para efeitos tóxica19.
Na metodologia detalhada neste trabalho, algumas das etapas essenciais que devem ser executados extra cuidadosamente incluem o seguinte: escolha um prato com bem alimentados c. elegans adultos com ovos maduros visíveis sob o microscópio de dissecação é essencial, e Falha ao seguir esta etapa irá resultar em um tamanho de amostra insuficiente de embriões para o experimento Exposição EDC. Também é importante para se certificar de que a solução de hipoclorito é feita fresca para evitar a obtenção de uma população não sincronizada que irá interferir com a capacidade de realizar exposição BPA durante a embriogênese precoce. Lavagem de pelotas com M9 (após a exposição de hipoclorito) também é um passo muito importante. Se não for feito corretamente, a alta concentração de água sanitária pode resultar em embriões mortos. Além disso, os embriões devem ser transferidos para placas NGM semeadas após 4 h. Se deixada na solução de BPA por um período prolongado de tempo, os embriões são propensos a desenvolver para as larvas de dauer long-lived. Isto irá interferir significativamente com ensaio de fecundidade e ensaios comportamentais. Se qualquer uma dessas etapas é perdida, é aconselhável começar o procedimento desde o início. Se por qualquer motivo, a placa NGM com vermes está contaminada ou não tem comida suficiente, ele irá adicionar o stress sobre os vermes desse modo distorcer os dados coletados. Tais placas devem ser descartadas e não ser usadas no experimento.
Anteriormente, um notável estudo utilizado com sucesso o modelo de c. elegans para demonstrar que anomalias cromossómicas causaram pelo resultado BPA, devido a avaria da maquinaria de reparo de DNA no germline14. No entanto, é notável que o projeto de estudo acima tinha usado a exposição contínua do BPA de c. elegans a altas doses de BPA durante toda sua vida. Nossa metodologia foi projetada para estudar a baixas doses de exposição BPA durante a embriogênese precoce, a fim de ensaiar seus efeitos sobre a viabilidade embrionária e sutis efeitos de longo prazo sobre os sobreviventes. A nosso conhecimento, nenhuma metodologia foi desenvolvida para expor os embriões adiantados palco para muito baixas doses de BPA, limitado a um período especificado de tempo; assim, tornando o método apresentado aqui romance.
Além disso, os protocolos fornecidos aqui pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de outros CDE durante a fase de proliferação da embriogênese. No entanto, a fim de estudar a tarde estágios embrionários, o protocolo exigirá modificações chaves para a janela de tempo crítico de desenvolvimento sob foco. Além disso, nosso protocolo não será adequado para experimentos que exigem tempos mais longos de exposição tóxica, como abre a possibilidade da via de desenvolvimento alternativo, resultando na detenção longeva dauer no segundo ciclo muda, que é resistente para condições severas de20. Outras modificações e aperfeiçoamentos serão necessários para tempos mais longos de exposição através de suplemento com uma fonte de alimento que não tem potencial para metabolizar a toxicidade ou EDC por exemplo autoclavado Escherichia coli. Em conclusão, nossa metodologia pode ser utilizada para avaliar os efeitos de vários produtos químicos sobre a fecundidade e na função neuronal endócrinos no sistema de invertebrados modelo c. elegans.
The authors have nothing to disclose.
Suporte pelo NSF (EPSCoR EPS-0814251) e reconhece com gratidão-NIH (1P20GM103653-01A1) para MKT e HSD, suporte de estudante institucional da Universidade Estadual de Delaware para MDM (título III HBGI) e KRS (NIH-INBRE). Graças ao centro de genética c. elegans (suportado pelo NIH escritório de pesquisa programas de infra-estrutura P40 OD010110) para c. elegans estirpe selvagem-tipo N2.
NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
Peptone | Fisher | S25761B | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
K2HPO4 | Fisher | 7758-11–4 | |
KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
Bleach | Clorox | n/a | |
Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
LB | Fisher | BP1426-500 | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |