השלכות התנהגותיות, הרבייה לטווח ארוך של חשיפה עובריים חשיפה לרעלים במינון נמוך

פרוטוקולים כדלקמן יש כבר סטנדרטית כדי לבחון את ההשפעה של חשיפה BPA במהלך המוקדמות מופרה, עשוי להיות שונה לשימוש עם BPS BPF או אחרים והריון, חשיפה לרעלים ב- C. elegans עוברי. 1. חומרים ההתקנה להכין 500 מ”ל של מדיה צמיחה תולעים נימיות (NGM)18 מדיה על ידי המסת 1.5 גר’ NaCl, g 1.25 של peptone ו- 8.5 גר’ אגר במים עד 500 מ”ל. לאחר autoclaving (121 מעלות צלזיוס, 15 PSI, 20 דקות), להוסיף 0.5 מ”ל של כולסטרול (5 מ”ג/מ”ל אתנול), 0.5 מ של MgSO 1 מ’4, 0.5 מ של 1 מ’ CaCl2 ו- 1 מ’ אשלגן פוספט מאגר, pH 7.4 (g 108.3 של ח’2PO4 מ”ל 35.6 g K2HPO4, מים 1 ליטר). להכין פתרון תת-כלורי על ידי ערבוב 25 מ ל 1 N קו 4 מ”ל של אקונומיקה, 71 מ ל מים. להפוך פתרון זה טרי. הכנת מאגר M9 על ידי ערבוב דור 3 של2פו ח’4, 6 גר’ נה2HPO4, 5 g של NaCl, 5 מ של 1 מ’ MgSO4, עם המים כדי ל’ 1 להכין מאגר S18 על ידי ערבוב מ”ל 129 של 0.02 נקודות M K-2-HPO-4, 871 מ של ח’2PO4ו- g 5.85 של NaCl. לעקר את מאגרי M9 ו- S על-ידי autoclaving. לגדול תרבות לילה של Escherichia coli (OP 50 זן) ב- 20 מ של מרק לוריא (ליברות). להמיס BPA ב 10% אתנול לעשות פתרון מניות 1 מ מ. להפוך דילולים עוקבות של 0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר ו- 10 מיקרומטר במאגר S.הערה: דילול במאגר S מימית מקטינה באופן משמעותי את ריכוז האתנול; לדוגמה, הריכוז הגבוה ביותר BPA שמתואר פרוטוקול זה (10 מיקרומטר), הריכוז של אתנול הוא 0.1% v/v. 2. C. elegans Culturing וסינכרון שופכים את המדיה NGM לתוך צלחות 100 מ מ (כ-25 מ ל/צלחת) ולאפשר לחזק. ברגע פני השטח למוצק, זרע את הצלחות על ידי הפצת µL 150 של e. coli OP50 מתרבות נוזלי גדל בין לילה. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, העברה N2 תולעים על גבי הלוחות החדשים על-ידי chunking של לוח משוער של 1 ס מ מרובע. לאפשר תולעים לצמוח למשך 3 ימים ב- 20 ° C עד הצלחת מאוכלסת מבוגרים מוזן היטב, המכיל עוברי גלוי. כדי לסנכרן, לשטוף כל צלחת על-ידי pipetting עד 5 מ של מאגר M9 על פני הלוח. להעביר את הנוזל שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ”ל.הערה: סינכרון נעשית להשמדת תולעים בוגרות ולאסוף עוברי כי הם יחסית אותה במה. צנטריפוגה ב 3000 g x במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר על מנת לקבל גלולה רופף של תולעים בוגרות. באמצעות פיפטה של 10 מ”ל, הסר בזהירות את תגובת שיקוע כדי להשאיר את גלולה ללא פגע. הוסף 5 מ של הפתרון תת-כלורי ומערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב x 3000 g בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות. להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה 10 מ”ל, לשטוף עם mL 7 M9 המאגר. חזור על שלב זה פעמיים. 3. חשיפת תולעים ל- BPA לאחר לשטוף את האחרון מ שלב 2.7 לעיל, להשעות µL כ-100 ביצים עם מאגר M9. להעביר כ-50 µL ביצים microfuge 2 mL צינורות כבר המכיל הריכוז המתאים ש-BPA מדולל במאגר S. התאימו את כמות S-מאגר כדי להבטיח את הריכוז הסופי הנכון של BPA (מיקרומטר 0.0, 0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, מיקרומטר 1.0, מיקרומטר 5.0 ו- 10 מיקרומטר) למחזור. טבלה 1 מדגים דרך אחת דילולים אלה. ריכוז BPA הסופי במניה BPA (100 μM) מאגר S תולעים מסונכרן 0.1 ΜM 1 ΜL 949 ΜL 50 ΜL 0.5 ΜM 5 ΜL 945 ΜL 50 ΜL 1 ΜM 10 ΜL 940 ΜL 50 ΜL 5 ΜM 50 ΜL 900 ΜL 50 ΜL 10 ΜM 100 ΜL 850 ΜL 50 ΜL טבלה 1: מניות BPA, מאגר S ותולעים מסונכרן המשמש להשגת ריכוז הרצוי משמש המחקר שלנו. במקום צינורות על מטרף ומנערים בעדינות במשך 4 שעות ב- 20° C, סל ד 25 עבור מטרף רוטרי או מטה/דקה 25 עבור מטרף נדנדה. לאחר 4 שעות, מניחים צינורות מחזיקי צינור ולאפשר תולעים להתיישב. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר להעביר תולעים ללוחות הזריעה (NGM צלחות עם OP50 e. coli). להפוך את התרבות OP50 e. coli נוזלי כאמור ב- 1.5, זרע את לוחיות הרישוי כאמור 2.1. תעזוב את התולעים גדלים עבור 60 h ב- 20 ° C. בדוק לוחות בכל יום עבור זיהום. צלחות NGM מזוהמים בדרך כלל דהוי, בליווי מושבות בודדות. בדיקת תולעים במיקרוסקופ לחיפוש צפיפות יתר. חוסר OP50 e. coli הדשא ותולעים מרוכזים מקומות קטנים מרמזים צפיפות יתר. 4. הקדמי מגע Habituation Assay העברת כ 10 מסונכרן הצעיר לאסוף תולעים בוגרות ללוחות חדש unseeded NGM באמצעות חוט פלטינה 30 G מחוטא-אש. להשאיר תולעים ללא הפרעה במשך 5 דקות כדי לאפשר להם זמן להתאקלם לצלחת חדשה. על התגובה habituation, להשתמש של שיער הגבות המצורפת לקצה של שיפוד עץ או קיסם, לעקר בטבילת 70% אתנול. לנגב עם טישו נקייה נטולת ולחכות 1 דקות עבור אתנול מתמוססות חופש. לגעת בעדינות את התולעת על הראש (קדמי של הנורה בלוע) באמצעות שיער הגבה. חזור על הנגיעות, ומאפשר 10 s בין נגיעות על מנת לאפשר את התולעת להתאושש. ממשיכים לגעת (המאפשר 10 s במרווחים interstimulus) עד התולעת כבר לא זז אחורנית. בשלב זה, התולעת יש בלתי כדי הגירוי. רשום את מספר נגיעות הדרושות התולעת habituate. לנתח את ההפרש בין שיעור habituation אכזרי של הפקדים טיפול ללא טיפול באמצעות חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן לאחר הוק של Tukey. 5. תולעת פוריות Assay להעביר תולעים L3 בודדים צלחת הזריעה ורענן באמצעות איסוף פלטינה. ודא כי התולעת היחידה הזאת מניחים בכל צלחת.הערה: לאחר, הזחל L3, תולעים להתפתח L4 הפרפרים והעשים ובבגרות. נוח לקטוף אותם מוקדם כי הם גדולים מספיק להעברת חיות בודדות תוך הבטחת כי הם לא כבר הניחו ביצים אשר אחרת יהיו חסרים בספירה. לספור את המספרים של ביצים זיון בכל 12 – 24 h. לאחר ספירת, להעביר את התולעת האב צלחת חדשה. חזור עד התולעת מפסיקה הנחת ביצים, בדרך כלל אחרי 5 ימים כאשר מודגרות ב 20 º C.הערה: בממוצע, תולעת פראי סוג יכולה להטיל ביצים עד 300; לכן, העברת ההורה צלחת חדשה מדי יום מונע צפיפות יתר. לנתח את ההבדל בין המספר הממוצע של ביצים שמטילים את הפקדים טיפול ללא טיפול באמצעות חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן לאחר הוק של Tukey.