転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

すべてのメソッドは、調和とヘルムホルツ ツェントルム ミュンヘンの機関、州、および連邦政府のガイドラインの遵守です。 1. 準備 タイム スケジュールを含む実験のセットアップの詳細な計画を立てる方法ごとに細胞を収穫するときと細胞培養培地に 4sU を追加するとき。生物の質問に応じてサンプル図面と 4sU ラベルの時間と濃度 (表 1) の時間ポイントを慎重に検討します。注: セル実行可能性の 4sU の影響を確認し、ストレス応答事前に (「確認最適な 4sU ラベル付けの条件」代表結果と図 1の参照)。少なくとも 1 つのサンプルのそれぞれの方法の予備的なテストを実行することをお勧めします。品質と RNA ・ DNA の量はディープ シーケンス (プロトコルの専用参照してください部分) と高速練習ですが実験中にセルの穏やかな処理のための十分なかどうかを確認します。 各メソッドのすべての時点に必要な細胞数を計算 (主な T 細胞を使用する場合は、大まかな推定の表 2を参照)。また、4sU RNA (例えば、時間ポイント翻訳レートまたは RNA 回転率を計算する必要がありますのためにだけ) よりちょうど総 RNA の少ないサンプルを配列することを検討してください。確認して (推奨) 結果の有効性を確認するには、少なくとも 1 つの生物の複製を作成します。注: 重要なは、すべてのメソッドと連続した時間点、サンプル必要がありますセルの同じ開始プールから。各メソッドの少なくとも 1 つの専用の研究者をお勧めします。 (例えば、検体の 4sU、シクロヘキシミド、哺乳類換散バッファー、および 1% のホルムアルデヒド) 事前に必要なすべてを準備します。4sU の付加の後でように明るい光に細胞を公開これは 4sU された RNA を細胞蛋白質18への架橋につながる可能性があります。 治療 (図 2) の前にちょうど 1 つのフラスコに興味のすべてのセルをプールします。(例えば診断と) のセルをカウントし、各メソッドの未処理のコントロールの必要量を使用 (また 4sU と 4sU seq の未処理のコントロールにラベルを付けることを忘れないでください)。残りのセルを扱うし、すぐに必要な各時点とメソッドのセル数を分割します。細胞を温度または CO2レベルの変化によるストレスを最小限に抑えるために可能な限り迅速に処理します。注: たとえば、採取、1 h、2 h と治療後 3 h しセルの 4 分の 1 は無処理、および処理コントロールの 4 分の 3 を使用します。 2. 4sU ラベル 注: このプロトコルは、Rädle から変更はら。19は 4sU で代謝ラベリング プログラムに関してさらに情報のためのプロトコルを参照してください。すべてのメソッドや連続した時間点、サンプルする必要がありますセルの同じ開始プールに属します。 ラベルの開始 使用直前の検体の 4sU を解凍します。興味のセルを含む培地に直接各時点での 4sU を追加 (表 2推奨の T 細胞数、時間あたり少なくとも 60 μ g RNA を参照)、優しく、ミックスし、インキュベーターに戻します。残りの 4sU dispose (再冷凍)。 ラベルの最後に、セル (例えば、セル スクレーパー) および 330 x g でポリプロピレン チューブ (これは高い g 力に抵抗) で 4 ° C で 5 分間遠心を収集します。培地を吸引し、RNA の隔離のための試薬を追加 (3 x 10 の6セルあたり 1 ミリリットル表示勧告のための材料を使用する) 各管に。完全に (3 x 106セルあたり 1 mL) ペレットを再懸濁します (RT)、室温で 5 分間インキュベート、-20 ° C の凍結サンプルは、少なくとも 1 ヶ月-20 ° C で保存できます。注意:RNA 分離用試薬は、皮膚や目に接触して得ること非常に危険です。取り扱いに注意して、安全上の注意. RNA による RNA の隔離のプロトコルを変更 RNA の隔離のための 1 mL 試薬あたり 0.2 mL のクロロホルムを追加し、前述の代謝ラベリング プロトコル (手順 1-12 2 15 s. 続行を揺することによって徹底的にミックスします。RNA 法による trizol のプロトコルを変更) Rädleらから。19 RNA 濃度を測定 (材料の表を参照)、製造元の指示に従って。この RNA を総 RNA シーケンスも使用 (手順 3 を参照してください。RNA シーケンスの合計) または少なくとも 1 ヶ月間-80 ° C で保存します。 新たに転写された RNA のチオール特定ビオチン化 総細胞 RNA の 30-80 μ g で開始します。60 μ g RNA は、新たに転写された RNA の十分な量を得られるはず。 標識反応を準備します。ピペット (RNA μ g) あたり次の順序で: 1 μ 10 x 7 μ L RNA ビオチン化バッファー (1 μ ヌクレアーゼ フリー H で希釈した RNA を含む2O)、および 2 μ L ビオチン HPDP (1 mg/mL)。ビオチン HPDP 最後、すぐにピペッティングで混ぜます。明るいライトへの露出を避けるためにアルミ箔でチューブをラップします。ビオチン HPDP の代わりのための議論を参照してください。回転で 1.5 時間室温で孵化させなさい。 2 分 15,000 × g で遠心分離機適切な 2 mL 管 (材料の表を参照してください) は、事前スピン 2 mL 管にピペットのビオチン標識 RNA のすべて、クロロホルムの等量を追加し、精力的に混ぜます。2-3 分を個別に開始段階までと泡が消え始めます。 4 ° C で 15 分間 15,000 × g で遠心します。慎重に新しいチューブに上層の水相を転送します。 2.3.3 の手順を繰り返します。2.3.4。ある時。10% 塩化ナトリウム (5 M) の量と等量のイソプロパノールを水相に追加します。4 ° C で 20 分 20,000 × g で遠心します。上清を捨てます。 作りたての等しいボリューム 75% エタノールを追加します。20,000 x g 破棄上清に遠心分離機、簡単に言えば、スピンし、残りのエタノールを削除します。30-100 μ L H2O (使用 1 μ L H2O 2.3.1 のステップから 1 μ g 入力 RNA あたり) ピペットを混合することによって完全に再懸濁します。 電気泳動分析 RNA の整合性を確認したり、因数を取得したり、後で確認します。 分離が新しく転写 (ラベル) 既存の (ラベル) の RNA と 4 ° C のストレージから常磁性ビーズ (材料の表を参照) を削除、室温にそれらを持って、少なくとも 30 分間放置します。熱 4sU 洗浄液 (サンプルあたり 3 mL) 65 ° c 100 mM ジチオトレイトール (DTT) ソリューションを準備します。超微細の DTT の重量を量る、ヌクレアーゼ フリー水の必要量を追加します。常に新鮮な準備します。サンプルあたり 200 μ L を使用します。 ビオチン標識 RNA サンプル (1 μ g/μ L) を変化させなさい、すぐに氷の上に 10 分の 65 ° C の熱します。ビオチン標識 RNA に 100 μ L ストレプトアビジン ビーズを追加し、RT で回転 15 分間インキュベートします。 適切な列を配置 (提言の材料表を参照) の各マグネット スタンドにサンプルの事前 1 mL 室温 4sU 洗浄バッファーの各列を平衡します。注: これは約 5-10 分かかります。任意の列は 5 分後に排水を開始しないでください場合、は、手袋をはめた指で列の上に軽く押します。 各列の中間に RNA/ビーズ ミックスを適用されます。ラベル付けされていない RNA を回復する必要がない限り流れを破棄します。もしそうなら、フローを通じて、少なくとも最初の洗浄を収集します。前述の Rädleらによって RNA の回復を実行します。(1-7、7 ステップします。ラベルのない、非連結のリカバリー)19。 (ステップ 2.4.2 から 65 ° c 焼く。) 0.9 mL 4sU 洗浄バッファーと 0.9 mL RT 4sU 洗浄バッファー、3 回をそれぞれ洗浄します。 常磁性ビーズを使用して、新しく転写 RNA を回復します。チャンネルフォーマット、および各列の下にある場所の管によく分散している RT 常磁性ビーズの 400 μ L をピペットします。100 μ L 100 mM DTT で新しく転写 RNA を溶出します。3 分待つし、100 μ 100 mM DTT と 2 番目の溶出を実行します。(オプション: Rädleらによって記述された溶出や回復を実行)19 ミックスは新しくピペット 10 倍の混合による RNA/ビーズを徹底的に転写し、製造元のガイドラインに従って進みます。ヌクレアーゼ フリー 11 μ L の RNA を溶出 H2適切な蛍光光度計を使用して O.Quantify RNA (材料の表を参照してください)。RNA は、少なくとも 1 ヶ月間-80 ° C で保存できます。注: 新しく転写 RNA は次世代シーケンシングの cDNA ライブラリを準備する使用ことができます (使用するキットの提案の材料表を参照してください) またはそれ以上の下流解析。100-500 ng RNA はほとんど図書館準備キット (説明参照) に対して十分です。 3. 総 RNA シーケンス 4sU 総 RNA シーケンスの RNA の隔離のプロトコルの変更された試薬を使用して RNA 調製後 RNA をラベルから RNA を直接取る (2.2.2 の手順を参照してください)。 ライブラリの準備のため希釈 50 100 ng の最終的な集中に RNA 因数/μ L。 新しく転写 RNA のライブラリの準備に関しては同じキットを使用します。100-500 ng RNA は十分ほとんどのライブラリ作成キットです。 4. リボソームのプロファイリング 注: すべてのメソッドや連続した時間点、サンプルはセルの同じ開始プールからする必要があります。材料表を参照して、使用するキットの推奨事項。 準備とリボゾームの分離 (RPFs) の断片を保護されます。 各時点の細胞の適切な量を使用 (推奨される T 細胞数の表 2を参照してください)。製造元のプロトコルに従って、シクロヘキシミドと付着性のセルを扱います。注意: シクロヘキシミド、毒性、突然変異を起こすことがあります。皮膚への接触や吸入を避けます。 収集とプール非- または半-adherent 細胞たび 1 つポリプロピレン チューブにポイントし、セル固有の媒体 (例えば、T 細胞に補われた RPMI) 1 mL あたり 1 x 10 の6セルを最終濃度を調整します。最終濃度 0.1 mg/mL とシクロヘキシミドを追加、ポリプロピレン チューブを反転してミックス、4 ° C で 330 x g で 5 分間遠心分離セル 1 分間インキュベート培地を吸引し、少なくとも 10 ml の PBS シクロヘキシミド (最終濃度 0.1 mg/mL) を添加した細胞を洗ってください。 4 ° C で 330 x g で 5 分間遠心分離細胞培地を吸引し、10 x 10 の6セルあたり 100 μ L 哺乳類の細胞の換散バッファーを追加します。ピペッティングで混ぜるし、完全に細胞を溶解する滅菌 22 25 ゲージ針を通して排出します。 冷却 1.5 mL チューブに細胞ライセートを転送します。周期的な逆転と氷の上に 10 分間インキュベートします。ライセートを明らかにする 4 ° C で 20,000 × g で 10 分間遠心します。冷却 1.5 mL チューブに上清を転送します。 準備、1:10 ヌクレアーゼ フリー水と分光光度計を使用してレコード A260読書ライセートの希薄化。ヌクレアーゼ フリー水を使用して、空白や、1:10 の標準として哺乳類の細胞の換散バッファーの希釈。次の式に従ってライセート A260/mL の濃度を計算します。(260セル lysate -260哺乳類の換散バッファー) 10 希釈係数 x =260/mL 氷の上の液 200 μ L 因数を作成、ヌクレアーゼ治療に進みます。注: 必要に応じて、100 μ L 分注を総 RNA の準備、10 %sds の 10 μ L を追加し、ミックスします。4 ° C で保存、4.3.2 に進みます。4sU 標識 RNA からの総 RNA の使用をお勧めします (手順 3 を参照してください。総 RNA の seq)。 リボソームのフット プリント ライセート凍結せずヌクレアーゼ治療をすぐに実行します。各 A260ライセートのヌクレアーゼ (おすすめのキットに含まれる) の 7.5 単位を追加します。たとえば: 80 A260/mL 0.2 mL x 7.5 U/A260ヌクレアーゼ ライセート x ライセート 120 U ヌクレアーゼを =。注: は、前述の製造元によって必要に応じて、消化ヌクレアーゼを滴定します。 穏やかな混合と RT の 45 分のヌクレアーゼ反応を孵化させなさい。液体窒素でライセートの 200 μ 因数を凍結し、-80 ° C で保存または 15 μ L RNase 阻害剤を各 200 μ L 分注に追加することによってヌクレアーゼ反応を停止、4.3.2 の手順に進みます。 RPFs の精製 ヌクレアーゼ消化 RPFs のサンプルを 1 つの固定を解除し、15 μ L RNase 阻害剤を追加します。氷のサンプルを保ちます。 製造元のプロトコルに従って RPFs を浄化 (コラムの浄化をお勧めします) と分光光度計の RNA 濃度を測定します。 rRNA の枯渇 RRNA 枯渇のため精製 RPFs の 5 μ g を使用します。 製造元のプロトコル (手順 1-2、プライマリ rRNA 枯渇) rRNA の枯渇のために従ってください。RRNA の RNA 濃度を測定は、分光光度計の RPFs を枯渇しました。 RPFs のページ浄化 RRNA の使用 500 ng は、ページ浄化用の RPFs を消耗しました。 ページの浄化のため、RNA の制御、サンプル、および梯子を準備します。ミックス 5 μ L の RNA 制御して 5 μ L 変性ゲルのローディングの 0.5 mL の遠心管に染料。ミックス 10 μ L 各 RPF のゲルを読み込み、それぞれの変化の 10 μ L。はしご因数を準備 (4 μ L 20/100 梯子、ヌクレアーゼ フリー水 1 μ L、5 μ L を変化させるゲルのローディングの染料)。各サンプルと守を防ぐために制御の間にロードします。 95 ° C、5 分のインキュベーションでサンプルとはしごを変化させなさい、すぐに氷の上。各サンプルの 20 μ L を読み込む (10 μ L と残りの 20 ° C でのサンプルの凍結、必要に応じてロード) 12% または 15% 尿素ポリアクリルアミドのゲルに梯子を準備の 10 μ L で区切られました。10 μ L の RNA コントロールをロードします。ブロモフェノール ブルー バンド ゲル (180 V ~ 70 分) の下部に達するまでゲルを実行 (図 3)。 4 ° C で製造元のプロトコルに従ってゲルを染色します。RNA を視覚化する青い光を発する暗視野 transilluminator を使用します。消費税 〜 28 と 30 に対応する各サンプルのゲルのスライスの長さの nt。参照として RNA の制御を取るし、それ。注: RPFs は、ほとんど見えない。サンプルが表示されない場合でもを含む長さの 28 と 30 nt の 2 つ oligos – RNA 制御によって示されるサイズでスライスを切除します。 滅菌 20 ゲージ針で 0.5 mL の遠心管の底に穴をあけます。別々 のチューブと 1.5 mL チューブのキャップの場所管に各ゲルのスライスを転送します。12,000 × g. 繰り返し遠心分離ゲルのスライスは、1.5 mL チューブに完全に寸断されない場合で 2 分間遠心します。 4 ° C でそれぞれ一晩 400 μ L ヌクレアーゼ フリー水、40 μ L 酢酸アンモニウム (5 M)、2 μ L SDS (10%) と中断のゲルのスライスからの RNA を溶出します。 (ワイドボア ヒントや切り口でチップを自作 1 mL) 1 mL ピペット チップとスラリーを 1.5 mL フィルター チューブ (おすすめキットに付属) に転送します。分離する 2,000 x g で 3 分間遠心分離機は、ゲルのスライスから RNA を溶出します。1.5 mL チューブに水溶液をゆっくりピペットします。2 μ L グリコーゲン (おすすめキットに付属) と 700 μ L 100% イソプロパノール ストアを追加少なくとも 1 時間-20 ° C で。 13,000 x g に 20 分のための 4 ° C で遠心分離機の破棄上清。G. 破棄清 × 13,000 で 10 分の 4 ° C であらかじめ冷えた作りたて 80% エタノールでペレットを洗浄し、空気乾燥します。20 μ L の各サンプルと 8 μ L ヌクレアーゼ フリー水に RNA 制御を再懸濁します。必要な場合は、-20 ° C で保存します。 断片化、最後修理 3′ アダプター結紮、逆のトランスクリプション 製造元のプロトコル (断片化と終わり修理、3′ アダプター結紮、および逆のトランスクリプション) で説明されているように手順を実行します。 CDNA のページ浄化 ページの浄化のためのサンプル、RNA 制御および梯子を準備: ミックス 10 μ L の各サンプルと RNA 制御 10 μ L をゲルのローディングの染料、それぞれの変化します。はしご因数を準備 (4 μ L 20/100 梯子、1 μ L ヌクレアーゼ フリー水、5 μ L をゲルのローディングの染料の変化)。各サンプルと守を防ぐために制御の間にロードします。 95 ° C、5 分のインキュベーションでサンプルとはしごを変化させなさい、すぐに氷の上。各サンプルの 20 μ L を読み込む (10 μ L と残りの 20 ° C でのサンプルの凍結、必要に応じてロード) 10% ポリアクリルアミド/7 – 8 M 尿素/TBE ゲルに梯子を準備の 10 μ L で区切られました。10 μ L の RNA コントロールをロードします。ブロモフェノール ブルーは、ゲル (180 V ~ 60 分) から完全に移行するまでは、ゲルを実行します。 4 ° C で製造元のプロトコルに従ってゲルを染色します。RNA を視覚化して、70 〜 80 nt に対応する各サンプルのゲルのスライスに青発光暗視野 transilluminator を使用します。 4.5.5 – 4.5.8 の手順で説明するように進むし、10 μ L ヌクレアーゼ フリー水の各サンプルを再懸濁します。 cDNA 環状 氷の各サンプルの次の試薬を組み合わせることにより、すべての反応に十分な環状のマスター ミックスを準備: 4.0 μ L 2.0 μ L、2.0 μ L MnCl2、2.0 μ L ATP 環状反応ミックス リガーゼ。 マスター ミックスの 10 μ L を各サンプルに追加します。優しく混ぜ、遠心分離機の簡潔に。すぐに氷のサンプルの場所 2 のための 60 ° c のサンプルをインキュベートします。 PCR の拡大 製造元のプロトコル (手順 1-3、PCR 増幅) PCR の拡大のために従ってください。最良の結果を達成するために主な T 細胞の 9 の PCR のサイクルの増幅用円形 cDNA の 4 μ L を使用します。 ライブラリを浄化し、製造元のプロトコル (手順 4-8、PCR 増幅) によるとその大きさの分布状況を確認します。増幅されたライブラリの予想サイズは 140-160 bp (図 4を参照)。 シーケンス ライブラリ、製造元のプロトコルおよび詳細については、シーケンス機能を参照してください。 5. チップ Seq 注: このプロトコルが変更 Blecher Gonen からら。14チップ以下に関する詳細について、プロトコルを参照してください。すべてのメソッドと連続時間ポイント、セルの同じ開始プールからサンプル必要があります。 架橋とセルを収穫 架橋数の最終 cellspecific 媒体 (例えば、T 細胞に補われた RPMI) 室温で 10 分間の 1% のホルムアルデヒド濃度と各時点の細胞 (推奨される T 細胞数の表 2を参照してください)穏やかなロッキング。0.125 M の最終的な集中にグリシン添加による架橋反応を停止します。 4 ° C で 5 分間 330 × g で遠心分離細胞上澄みを廃棄し、氷冷 PBS のセルを洗浄します。5.1.2 の手順を 2 回繰り返し、-80 ° C で細胞ペレットを凍結冷凍餌は、少なくとも 6 ヶ月間保存できます。 セル換散および超音波処理注: すべてのセル換散および超音波処理ステップの間に、氷の上や架橋反転とタンパク質の劣化を最小限に抑えるための 4 ° C でサンプルを保たれなければなりません。 1 mL 冷たいセル換散バッファー (ホスファターゼの抑制剤を必要に応じて追加) 核を分離する新しく追加されたプロテアーゼ阻害で細胞ペレットを再懸濁します。氷と 2,600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心する上で 10 分間インキュベートします。 上清を吸引し、新しく追加されたプロテアーゼ阻害剤 1 mL 冷たい核換散バッファーで核ペレットを再懸濁します (必要に応じて: ホスファターゼの抑制剤を追加)。氷で 10 分間インキュベートします。0.2 – 1.0 kb の平均 DNA サイズ画分を生成する細胞を超音波 (図 5参照)。注: セルの種類に応じて最適化し、さらに超音波照射条件必要条件 (例えば細胞数、ボリューム、およびバッファー)。主な T 細胞の 20-25 サイクルの超音波処理推奨します (詳細な説明の資料を参照してください)。 せん断クロマチンと 95 ° C で、1,000 rpm 高速逆架橋を行い、クロマチンのサイズを確認するために揺れ 10 分間熱の分注 20-50 μ L を取る。プロティナーゼ K 2-5 μ L を追加し、56 ° C および 1,000 の rpm の振動で 20 分間インキュベートします。95 ° C および 1,000 rpm の振動で 10 分間の熱不活化を実行します。適切なキットレンズ クロマチンを浄化 (材料の表を参照してください)。1% アガロースゲルのクロマチン サイズを確認し、100 bp プラス マーカーを使用します。 不溶解性クロマチンと破片をペレットにせん断クロマチン DNA サイズ量 0.2 – 1.0 kb 20,000 × g と 4 ° C で 10 分間の平均を遠心します。上清を新しいチューブに転送して氷の上。 入力として熱量クロマチンの 5-10% を維持します。(5.5.2 のステップで使用される)-20 ° C で凍結します。 カップル抗体ビーズ カップル 10 μ g 抗体 (例えば、抗 RNA Pol II; 抗ヒストン H3K36me3) 220 μ L の PBS で (0.5% 0.5 %bsa とトゥイーン 20) 80 μ L 超常磁性ビーズ G の蛋白質に結合する (材料の表を参照してください) 回転に室温で少なくとも 1 時間。 磁石にチューブを置きます。すべてのビードは磁石にバインドされ、上澄みを除去まで待ちます。6 μ L でさらにブロック超音波処理サケ精子 DNA PBS (0.5% 0.5 %bsa とトゥイーン 20) 回転と室温で 30 分間。 磁石にチューブを置きます。すべてのビードが磁石にバインドされている明確な上清を除去まで待ちます。チップの IP バッファーとビーズを 3 回洗浄します。 クロマチン免疫沈降 クロマチンたて追加プロテアーゼ阻害剤で核換散バッファーの容量は 1 mL を希釈 (必要に応じて、ホスファターゼの抑制剤を追加)。新しく追加されたプロテアーゼ阻害剤とチップの IP バッファーを追加 (必要に応じて、追加のホスファターゼの抑制剤) 3 mL の最終巻に。ビーズに抗体を結合しながら氷の上または 4 ° c を維持します。 抗体希釈クロマチン ステップ 5.3.3 からビーズを結合し、緩やかな回転で 4 ° C で一晩インキュベートを追加します。 回転で 5 分間室温で次のバッファー (各 1 mL材料表を参照してください) で洗って、磁石チューブをバックに、上清を除去: 洗浄バッファー類、洗浄バッファー II、洗浄バッファー III、および TE pH 8.0 x 2 それぞれ。 上澄みを廃棄し、~ 5 分風乾します。 逆に架橋 磁石からサンプルを削除します。50 μ L の溶出バッファーを加え、ビーズからタンパク質-DNA 複合体の溶出にピペッティングで混ぜます。 この一歩から入力の見本があります。最終巻 (維持するためにバッファー組成チップ サンプル) 50 μ l の試料を入力する溶出バッファーを追加とチップ サンプルと共にプロセス。 ミックス 3 μ L の溶出バッファーと rnase (DNase 無料) 2 μ L。各サンプルにミックスの 5 μ L を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート ミックス 2.5 μ L プロティナーゼ K、1 μ L グリコーゲンおよびサンプルあたり 1.5 μ L の溶出バッファー。(1 U プロティナーゼ K およびサンプルあたり 20 μ g のグリコーゲン) に各サンプルにミックスの 5 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間インキュベート 逆の架橋を実行する揺れで 65 ° C 一晩 (少なくとも 4 h) でサンプルをインキュベートします。 少なくとも 30 s と転送のための磁石にチューブを置く新しいチューブに上清。サンプルは、12 ヶ月の-20 ° C で凍結できます。 DNA 精製 よく分散した常磁性ビーズの 140 μ L を 60 μ L のサンプル (本邦比) に追加します。慎重に徹底的にミックスを 25 回上下ピペットします。各管の液が均質であることを確認します。2 分 4 分のため、またはすべてのビードまでマグネット チューブ、磁石にバインドされ、上澄みを廃棄場所の室温で孵化させなさい。 磁石にチューブを残すし、作りたての 70% エタノールを 200 μ l 添加します。30 のチューブをインキュベート ビーズを乱すことがなく s。上澄みを廃棄し、この手順をもう一度繰り返します。エタノールを完全に吸引し、常磁性ビーズが 4 分風乾します。メモ: 不完全なエタノールの除去可能性があります、真剣に DNA の回復を減らすし、降伏。それが乾燥するまでの間だけは、ペレットを乾燥します。ペレットを過剰乾燥 DNA の回復を軽減し、降伏。 磁石からチューブを外し、10 mM トリス-HCl (pH 8.0) 20 μ L を追加します。軽く混和 25 度上下全体のボリュームをピペットします。常温で 2 分間インキュベートします。4 分のための磁石にチューブを置き、上清を別のチューブに転送します。 適切な蛍光光度計と DNA の量を測定 (材料の表を参照してください)。 チップは qPCR (qPCR 用 100 μ l H2O および使用 2-5 μ L で希釈 1 μ L) によって成功したを確認します。肯定的な (興味の蛋白質の既知のバインディング サイト) のネガティブ コントロール (例えば、サイレントおよび/または興味の蛋白質のないターゲット遺伝子) 特異的プライマーを使用します。注: ライブラリの準備は 2 で実行できるキットによって DNA チップの ng (使用するキットの提案の材料表を参照してください)。