Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones
Summary
En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.
Abstract
Células estromales de la médula ósea (BMSCs) constituyen una población celular que se utilizan habitualmente como una representación de las células madre mesenquimales in vitro. Residen dentro de la cavidad de la médula junto con las células madre hematopoyéticas (HSCs), que puede dar lugar a células de sangre rojas, progenitores inmunes y osteoclastos. Por lo tanto, extracciones de poblaciones celulares de los resultados de la médula ósea en una mezcla muy heterogénea de distintas poblaciones de la célula, que puede presentar desafíos en diseño experimental y confundir la interpretación de los datos. Varios aislamiento y técnicas de cultivo se han desarrollado en los laboratorios para obtener poblaciones más o menos homogéneas de BMSCs y HSCs invitro. Aquí, presentamos dos métodos para el aislamiento de BMSCs y HSCs de huesos largos de ratón: un método que produce una población mixta de BMSCs y HSCs y un método que intenta separar las poblaciones dos celulares basan en la adherencia. Ambos métodos proporcionan las células convenientes para osteogénico y diferenciación adipogenic experimentos ensayos así como funcionales.
Introduction
Primarias BMSCs murinos se utilizan como un modelo en vitro de las células madre mesenquimales desde su descubrimiento en el temprano de años 19801. De hecho, cultivos de células de plástico adherente lavadas de la cavidad de la médula ósea de los huesos largos mantienen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos, osteoclastos, condrocitos o adipocitos en muchos estudios2,3, 4 , 5. sin embargo, la médula ósea es un tejido único compuesto de muchos diferentes poblaciones celulares incluyendo pero no limitado a, BMSCs, HSCs, células endoteliales e inmunes. Así, el aislamiento y técnicas de cultivo pueden producir poblaciones celulares con diferentes homogeneidad. Utilizando estas técnicas para probar el potencial de diferenciación de las células puede ser difícil. Por ejemplo, al comparar las células de los ratones con diferentes genotipos, a partir de una población celular mixta limita la interpretación de los datos. Por el contrario, obtención de poblaciones homogéneas de BMSCs y HSCs puede ser técnicamente difícil y no pueden estar como representante de un modelo ex vivo .
En nuestro laboratorio, estamos principalmente interesados en la utilización de BMSCs debido a su potencial para diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y osteoclastos. Aquí, presentamos las técnicas de aislamiento BMSCs y HSCs y cultura para evaluar osteoblastogenesis o adipogénesis en vitro, así como culturas de HSCs que se diferencian en osteoclastos. Un método utiliza una población mixta de células de médula ósea (BMC) que contiene BMSCs y HSCs directamente convenientes para la adipogénesis, osteoblastogenesis y osteoclastogénesis (llamado Total BMC). Este método es una representación ex vivo más cercana de la heterogeneidad entre las células del microambiente de la médula ósea. Otro método separa adherente de las células no adherentes en un intento de poblaciones “más puros” cultura de BMSCs y HSCs (llamadas BMSCs adherente). El método más adelante permite la cultura de célula experimentos para iniciar con un número más exacto de BMSCs o HSCs y reduce la posibilidad de efectos indirectos complejos de otras poblaciones de células que permanecen en la cultura. Ambos métodos han sido previamente publicados y utilizado para abordar la investigación preguntas6,7,8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se presentan dos métodos de cultura de BMSCs con sus ventajas y limitaciones. Aislar las células de la médula ósea es un proceso relativamente fácil. Sin embargo, obtener una población celular representativa de las células madre mesenquimales o progenitores osteoclástica puede ser difícil debido al diverso ambiente celular de la cavidad de la médula.
Cultivo de la totalidad de los contenidos de la médula ósea proporciona una representación cercana del microambie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01 AR061164-01A1).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
