Summary

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Published: January 06, 2018
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Summary

En este artículo se presentan métodos para aislar y diferenciar las células estromales de médula ósea y células madre hematopoyéticas de los huesos largos de ratón. Dos protocolos diferentes presentan rendimiento diferentes poblaciones celulares adecuadas para la expansión y diferenciación a osteoclastos, osteoblastos y adipocitos.

Abstract

Células estromales de la médula ósea (BMSCs) constituyen una población celular que se utilizan habitualmente como una representación de las células madre mesenquimales in vitro. Residen dentro de la cavidad de la médula junto con las células madre hematopoyéticas (HSCs), que puede dar lugar a células de sangre rojas, progenitores inmunes y osteoclastos. Por lo tanto, extracciones de poblaciones celulares de los resultados de la médula ósea en una mezcla muy heterogénea de distintas poblaciones de la célula, que puede presentar desafíos en diseño experimental y confundir la interpretación de los datos. Varios aislamiento y técnicas de cultivo se han desarrollado en los laboratorios para obtener poblaciones más o menos homogéneas de BMSCs y HSCs invitro. Aquí, presentamos dos métodos para el aislamiento de BMSCs y HSCs de huesos largos de ratón: un método que produce una población mixta de BMSCs y HSCs y un método que intenta separar las poblaciones dos celulares basan en la adherencia. Ambos métodos proporcionan las células convenientes para osteogénico y diferenciación adipogenic experimentos ensayos así como funcionales.

Introduction

Primarias BMSCs murinos se utilizan como un modelo en vitro de las células madre mesenquimales desde su descubrimiento en el temprano de años 19801. De hecho, cultivos de células de plástico adherente lavadas de la cavidad de la médula ósea de los huesos largos mantienen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos, osteoclastos, condrocitos o adipocitos en muchos estudios2,3, 4 , 5. sin embargo, la médula ósea es un tejido único compuesto de muchos diferentes poblaciones celulares incluyendo pero no limitado a, BMSCs, HSCs, células endoteliales e inmunes. Así, el aislamiento y técnicas de cultivo pueden producir poblaciones celulares con diferentes homogeneidad. Utilizando estas técnicas para probar el potencial de diferenciación de las células puede ser difícil. Por ejemplo, al comparar las células de los ratones con diferentes genotipos, a partir de una población celular mixta limita la interpretación de los datos. Por el contrario, obtención de poblaciones homogéneas de BMSCs y HSCs puede ser técnicamente difícil y no pueden estar como representante de un modelo ex vivo .

En nuestro laboratorio, estamos principalmente interesados en la utilización de BMSCs debido a su potencial para diferenciarse en adipocitos, osteoblastos y osteoclastos. Aquí, presentamos las técnicas de aislamiento BMSCs y HSCs y cultura para evaluar osteoblastogenesis o adipogénesis en vitro, así como culturas de HSCs que se diferencian en osteoclastos. Un método utiliza una población mixta de células de médula ósea (BMC) que contiene BMSCs y HSCs directamente convenientes para la adipogénesis, osteoblastogenesis y osteoclastogénesis (llamado Total BMC). Este método es una representación ex vivo más cercana de la heterogeneidad entre las células del microambiente de la médula ósea. Otro método separa adherente de las células no adherentes en un intento de poblaciones “más puros” cultura de BMSCs y HSCs (llamadas BMSCs adherente). El método más adelante permite la cultura de célula experimentos para iniciar con un número más exacto de BMSCs o HSCs y reduce la posibilidad de efectos indirectos complejos de otras poblaciones de células que permanecen en la cultura. Ambos métodos han sido previamente publicados y utilizado para abordar la investigación preguntas6,7,8,9.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso en el Instituto de investigación de centro médico de Maine. 1. colección tubos preparación Hacer los medios de cultivo CMMo complementando α medio esencial mínimo (MEM α) con 10% suero bovino Fetal y 1% de penicilina/estreptomicina. Coloque 100 μl CMMo de medios de cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. 3 huesos generalmente caben en un solo tubo así que p…

Representative Results

Resumen de las culturas de célulaLas técnicas de dos cultivo permiten la evaluación de la diferenciación en una población mixta de BMC de BMSCs y HSCs (BMC Total, figura 1A) o en una población de BMSCs separó de HSCs (BMSCs adherente, figura 1B). 48 horas después de que las células de la médula están aisladas y plateado (figura 1), que rápidamente en las partes inferi…

Discussion

En este artículo, se presentan dos métodos de cultura de BMSCs con sus ventajas y limitaciones. Aislar las células de la médula ósea es un proceso relativamente fácil. Sin embargo, obtener una población celular representativa de las células madre mesenquimales o progenitores osteoclástica puede ser difícil debido al diverso ambiente celular de la cavidad de la médula.

Cultivo de la totalidad de los contenidos de la médula ósea proporciona una representación cercana del microambie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01 AR061164-01A1).

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

References

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Cite This Article
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

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