Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen
Summary
In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.
Abstract
Knochenmark-Stromazellen Zellen (BMSCs) bilden eine Zellpopulation, die routinemäßig als eine Darstellung von mesenchymalen Stammzellen verwendet in-vitro-. Sie befinden sich in dem Knochenmark Hohlraum neben hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die roten Blutkörperchen, immun Stammväter und Osteoklasten hervorrufen können. So, Extraktionen der Zell-Populationen von der Knochenmark resultiert eine sehr heterogene Mischung aus verschiedenen Zell-Populationen, die Herausforderungen im experimentellen Design und Interpretation der Daten zu verwirren können. Mehrere Isolation und Kulturtechniken wurden im Labor entwickelt, um mehr oder weniger homogenen Bevölkerungen von BMSCs und HSCs Invitrozu erhalten. Hier stellen wir zwei Methoden zur Isolierung von BMSCs und HSCs aus Maus Röhrenknochen: eine Methode, die eine gemischte Bevölkerung von BMSCs und HSCs ergibt und eine Methode, die versucht, die zwei Zellpopulationen zu trennen Abkommen beruht auf. Beide Methoden liefern Zellen geeignet für osteogene und adipogenen Differenzierung Experimente sowie Funktions-Tests.
Introduction
Primären murinen BMSCs werden häufig als in-vitro- Modell von mesenchymalen Stammzellen seit ihrer Entdeckung in den frühen 1980er Jahren1verwendet. Kulturen der Kunststoff-anhaftende Zellen aus dem Knochenmark Hohlraum der langen Knochen gespült pflegen in der Tat, die Fähigkeit, differenziert in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten in vielen Studien2,3, 4 , 5. ist eine einzigartige Gewebe bestehend aus vielen unterschiedlichen Zellpopulationen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, BMSCs, HSCs, Endothelzellen und Immun-Zellen jedoch das Knochenmark. So können Isolation und Kulturtechniken Zell-Populationen mit unterschiedlichen Homogenität nachgeben. Mit solchen Techniken, um die mögliche Differenzierung von Zellen zu testen, kann schwierig sein. Z. B. Grenzen, wenn Zellen von Mäusen mit verschiedenen Genotypen zu vergleichen, beginnend mit einer gemischten Zellpopulation der Interpretation der Daten. Umgekehrt erhalten homogene Bevölkerung von BMSCs und HSCs technisch schwierig sein kann und möglicherweise nicht als Vertreter eines ex-Vivo -Modells.
In unserem Labor sind wir in erster Linie interessiert die Nutzung der BMSCs durch ihr Potenzial in Osteoblasten und Osteoklasten Adipozyten unterschieden werden. Hier präsentieren wir Ihnen Techniken der BMSCs und HSCs Isolation und Kultur verwendet, um Osteoblastogenesis oder angereizte in Vitrozu bewerten, sowie Kulturen von HSZ in Osteoklasten zu unterscheiden. Eine Methode verwendet eine gemischte Bevölkerung von Knochenmarkzellen (BMCs) mit BMSCs und HSCs direkt geeignet für angereizte, Osteoblastogenesis und Osteoclastogenesis (Total BMCs genannt). Diese Methode ist eine engere ex Vivo -Darstellung der Heterogenität zwischen den Zellen des Knochenmarks Mikroumgebung gefunden. Eine andere Methode trennt Anhänger von nicht-anhaftende Zellen in einem Versuch, Kultur “reiner” Populationen von BMSCs und HSCs (Anhänger BMSCs genannt). Die späteren Methode ermöglicht die Zellkultur um zu beginnen mit einer genauer Anzahl von BMSCs oder HSCs experimentiert und verringert das Potenzial von komplexen indirekten Auswirkungen der anderen Zell-Populationen, die in der Kultur bleiben. Beide Methoden haben zuvor veröffentlicht und verwendet, um verschiedene Forschung Fragen6,7,8,9anzugehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel werden zwei Methoden der Kultur des BMSCs mit ihren Vorteilen und Einschränkungen vorgestellt. Zellen aus dem Knochenmark zu isolieren, ist ein relativ müheloses Prozess. Erlangung einer Zellpopulation, die repräsentativ für die mesenchymalen Stammzellen oder osteoclastic Vorfahren kann jedoch aufgrund der vielfältigen zellulären Umgebung des Hohlraums Knochenmark eine Herausforderung sein.
Kultivierung der Gesamtheit der Knochenmark-Inhalte bietet einen engen Darstellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1) unterstützt.
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
