Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris
Summary
Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.
Abstract
Cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) constituent une population de cellules utilisée couramment comme une représentation de cellules souches mésenchymateuses in vitro. Ils résident dans la cavité de la moelle osseuse aux côtés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui peut donner lieu à des globules rouges, progéniteurs immunitaires et les ostéoclastes. Ainsi, les extractions de populations de cellules des moelle osseuse des résultats dans un mélange très hétérogène de diverses populations de cellules, qui peuvent présenter des défis dans une conception expérimentale et confondre l’interprétation des données. Plusieurs d’isolement et des techniques de culture ont été développés dans les laboratoires afin d’obtenir des populations plus ou moins homogènes de BMSC et csh invitro. Nous présentons ici deux méthodes pour isoler BMSC et GPX des os longs souris : une méthode qui génère une population mixte de BMSC et csh et une méthode qui tente de séparer les populations de deux cellules basées sur le respect. Les deux méthodes offrent adapté aux cellules ostéogéniques et différenciation adipocytaire expérimente des essais ainsi que fonctionnels.
Introduction
BMSC murine primaires est utilisées comme modèle in vitro de cellules souches mésenchymateuses depuis leur découverte dans le début des années 19801. En effet, les cultures de cellules adhérentes plastique vidées de la cavité de la moelle osseuse des os longs maintiennent la capacité à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes dans nombreuses études2,3, 4 , 5. Toutefois, la moelle osseuse est un tissu unique composé de plusieurs différentes populations cellulaires y compris, mais non limité à, BMSC, CSH, les cellules endothéliales et immunitaires. Ainsi, d’isolement et des techniques de culture peuvent produire des populations de cellules avec différente homogénéité. En utilisant ces techniques pour tester la potentiel de différenciation des cellules peut être difficile. Par exemple, lorsque l’on compare les cellules des souris avec des génotypes différents, commençant par une population de cellules mixtes limite l’interprétation des données. À l’inverse, obtention des populations homogènes de BMSC et csh peut être techniquement difficile et ne peut pas être aussi représentatif d’un modèle ex vivo .
Dans notre laboratoire, nous nous intéressons principalement à l’utilisation du BMSC en raison de leur potentiel à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes. Nous présentons ici les techniques d’isolement BMSC et GPX et de la culture utilisée pour évaluer l’osteoblastogenèse ou l’adipogenèse le in vitro, ainsi que des cultures de CSH se différencier en ostéoclastes. Une méthode utilise une population mixte de cellules de moelle osseuse (BMC) contenant BMSC et GPX directement adapté pour l’adipogenèse, osteoblastogenèse et osteoclastogenesis (appelé ca Total). Cette méthode est une représentation plus proche ex vivo de l’hétérogénéité trouvée parmi les cellules du microenvironnement de la moelle osseuse. Une autre méthode sépare adhérentes de cellules non adhérentes dans une tentative de culture plus « pur » des populations de BMSC et csh (appelé adhérent BMSC). La méthode plus tard autorise la culture cellulaire des expériences pour démarrer avec un nombre plus précis du BMSC ou GPX et réduit le potentiel des effets indirects complexes des autres populations de cellules qui restent dans la culture. Les deux méthodes ont été précédemment publiés et utilisés pour traiter différents recherche questions6,7,8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, deux méthodes de culture de BMSC sont présentées avec leurs avantages et leurs limites. Isoler les cellules provenant de la moelle osseuse est un processus relativement sans effort. Cependant, il peut être difficile en raison de l’environnement cellulaire diverse de la cavité de moelle d’obtenir une population de cellules représentante des cellules souches mésenchymateuses ou progéniteurs ostéoclastiques.
Cultivant l’intégralité du contenu de la moelle osseus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01 AR061164-01 a 1).
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
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