Summary

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Published: January 06, 2018
doi:

Summary

في هذه المقالة، نقدم طرق لعزل والتفريق بين الخلايا اللحمية في النخاع العظمى والخلايا الجذعية المكونة للدم من العظام الطويلة الماوس. وترد اثنين من البروتوكولات المختلفة الغلة السكان خلية مختلفة مناسبة للتوسع والتمايز في خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes والأكلة.

Abstract

نخاع العظم stromal خلايا (بمسكس) يشكل عدد سكانها خلية تستخدم بشكل روتيني كتمثيل الخلايا الجذعية الوسيطة في المختبر. يقيمون داخل تجويف نخاع العظم جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا الدم الحمراء وفروعه محصنة والأكلة. وهكذا، عمليات استخراج سكان خلية من نتائج نخاع العظام في خليط غير متجانس جداً سكان الخلية المختلفة، التي يمكن أن تشكل تحديات في التصميم التجريبي وارباك تفسير البيانات. وضعت عدة العزلة وتقنيات الثقافة في المختبرات من أجل الحصول على السكان متجانسة أكثر أو أقل من بمسكس وهسكس invitro. هنا، نحن نقدم طريقتين لعزل بمسكس وهسكس من العظام الطويلة الماوس: أسلوب واحد التي تسفر عن عدد سكان مختلطة من بمسكس وهسكس وأسلوب واحد أن المحاولات الرامية إلى فصل السكان الخلية اثنين استناداً إلى الالتزام. توفر كلا أساليب مناسبة للخلايا أوستيوجينيك، والتمايز أديبوجينيك تجارب معبراً كذلك وظيفية.

Introduction

بمسكس مورين الأولية تستخدم عادة كنموذج في المختبر للخلايا الجذعية الوسيطة منذ اكتشافهم في مطلع الثمانينات1. وفي الواقع، صون ثقافات خلايا البلاستيكية-تمسكا مسح من تجويف نخاع العظام الطويلة القدرة على تكون متباينة في adipocytes في العديد من الدراسات2،3، ، تشوندروسيتيس، خلايا الاوستيوبلاستس أو الآكلة 4 , 5-بيد أن نخاع العظم نسيج فريد يتألف من العديد من السكان خلية مختلفة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، بمسكس، الخلايا البطانية، ومحصنة ضد هسكس،. وهكذا، العزلة وتقنيات الثقافة يمكن أن تسفر عن السكان خلية مع التجانس مختلفة. باستخدام هذه التقنيات لاختبار المفاضلة المحتملة من الخلايا يمكن أن يكون تحديا. على سبيل المثال، عند مقارنة الخلايا من الفئران مع الأنماط الجينية المختلفة، بدءاً خلايا مختلطة سكان حدود تفسير البيانات. على العكس من ذلك، الحصول على السكان متجانسة بمسكس وهسكس يمكن أن يكون صعباً من الناحية التقنية ولا يجوز كممثل من طراز السابقين فيفو .

في المختبر، نحن مهتمون أساسا في الاستفادة بمسكس بسبب قدرتها على أن تكون متمايزة إلى خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة adipocytes. نقدم هنا، تقنيات العزل بمسكس وهسكس والثقافة المستخدمة لتقييم أوستيوبلاستوجينيسيس أو أديبوجينيسيس في المختبر، وكذلك الثقافات هسكس تفرق في الآكلة. يستخدم أسلوب واحد سكان مختلطة من “خلايا نخاع العظام” (بمكس) التي تحتوي على بمسكس وهسكس مباشرة مناسبة أديبوجينيسيس وأوستيوبلاستوجينيسيس وأوستيوكلاستوجينيسيس (تسمى بمكس المجموع). هذا الأسلوب توثيق السابقين فيفو تمثيل لعدم تجانس وجدت بين خلايا المكروية نخاع العظام. أسلوب آخر يفصل ملتصقة من الخلايا غير ملتصقة في محاولة لثقافة السكان “أنقى” بمسكس وهسكس (تسمى بمسكس ملتصقة). يسمح أسلوب لاحق ثقافة الخلية والتجارب للبدء بعدد أكثر دقة من بمسكس أو هسكس ويقلل من إمكانات مجمع الآثار غير المباشرة للسكان الخلية الأخرى التي ما زالت في الثقافة. نشرت كلا الأسلوبين سابقا وتستخدم لمعالجة مختلف البحوث الأسئلة6،7،،من89.

Protocol

وافق جميع الإجراءات التجريبية برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في معهد البحوث الطبية مين مركز. 1-جمع أنابيب إعداد جعل وسائل الإعلام الثقافة بمسك باستكمال “الحد الأدنى الأساسية المتوسطة” α (MEM α) مع 10% “مصل بقرى الجنين” و 1% من البنسلين/ستربتوميسين. ضع 100 ميليلت…

Representative Results

نظرة عامة حول الثقافات الخليةتسمح تقنيات الثقافة هما تقييم التمايز في عدد سكان مختلطة من بمكس تتألف من بمسكس وهسكس (مجموع بمكس، الشكل 1A) أو عدد سكانها بمسكس تقسيم من هسكس (بمسكس ملتصقة، الشكل 1B). 48 ساعة بعد أن يتم عزل الخلايا من ا…

Discussion

في هذه المقالة، يتم عرض طريقتين لثقافة بمسكس مع مزايا وقيود. عزل الخلايا من نخاع العظام وعملية سهل نسبيا. ومع ذلك، الحصول على عدد سكان خلية ممثل للخلايا الجذعية الوسيطة أو فروعه أوستيوكلاستيك يمكن أن تكون صعبة بسبب تنوع البيئة الخلوية تجويف نخاع.

استزراع مجمل محتويات نخاع ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (R01 AR061164-01A1).

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

References

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Play Video

Cite This Article
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

View Video