Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Schimmel posities in binnen- en beroepsmatige omgeving kunnen leiden tot respiratoire morbiditeit, met inbegrip van allergische sensibilisatie en astma¹. Identificatie van de gevaren van de schimmel is belangrijk voor de beoordeling van risico’s en het voorkomen van blootstelling van de werknemer. Deze schimmel gevaren kunnen een gevolg zijn van binnen besmetting, buitenlucht inbraak of verstoringen van het milieu die resulteren in het vervoer van schimmel materialen in gebieden waar werknemers aanwezig². Methoden voor het beoordelen van de schimmel blootstelling hebben opgenomen levensvatbare cultuur bemonstering, alsmede de microscopische identificatie van schimmelsporen. Deze benaderingen hebben verschillende beperkingen en vaak over het hoofd veel schimmel soorten die aan de algehele schimmel last^{3 bijdragen kunnen}. Cultuur gebaseerde benaderingen kunnen alleen die levensvatbare schimmel organismen die kunnen worden geteeld op voedingsbodems differentiëren. Identificeren van schimmelsporen naar soorten niveau via microscopie kan worden verward door sporen delen van soortgelijke morphologies. Beide methoden zijn sterk afhankelijk van mycologen te analyseren en identificeren van de schimmel soort, met veel resterende niet-geïdentificeerde.

Om te verbeteren op bestaande methodes gebruikt in occupational hazard identificatie en beoordeling van de blootstelling, hebben vele onderzoekers aan moleculaire gebaseerde technologieën gedraaid. Sequencing gebaseerde benaderingen voor de beoordeling van de microbiële diversiteit in binnen- en beroepsmatige omgeving is gebleken dat een breder spectrum van schimmel soorten ondervonden vergeleken met methoden zoals microscopie en levensvatbare cultuur^{3,4 ,5}. De hier gepresenteerde methode beschrijft de lucht bemonstering van beroepsmatige omgevingen en extractie van genomic DNA voor de identificatie van de potentiële gevaren van de schimmel. Identificatie van de gevaren gebeurt door de rangschikking van de nuclear ribosomal interne getranscribeerde spacer of ITS, regio’s die onder de schimmels zeer variabel zijn en zijn gewoonlijk gebruikt om schimmel soorten^{6,7, differentiëren 8,9}. Vele soorten gevonden in professionele instellingen, zoals sommige soorten die behoren tot de stam Basidiomycota, zijn niet identificeerbare in levensvatbare cultuur en zijn moeilijk te onderscheiden microscopisch. Deze schimmels zijn waargenomen in hoge relatieve overvloed in binnen- en beroepsmatige omgeving beoordeeld door sequentiebepaling schimmel ITS regio’s^3,4,10. DE volgorde heeft meer kennis verschaft in de diversiteit van de schimmels ondervonden in binnen- en beroepsmatige omgeving.

Het protocol beschreven hier details de methoden gebruikt voor het verzamelen, uitpakken en versterken van schimmel ITS-regio’s uit bioaerosols voor sequentieanalyse. Deze aanpak maakt gebruik van het National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) tweetraps cycloon aërosol sampler voor het verzamelen van deeltjes in de lucht. Deze sampler werd ontwikkeld voor het verzamelen van bioaerosols en separaat inadembare (≤4 µm aërodynamische diameter) en niet-respirabel (> 4 µm aërodynamische diameter) deeltjes, die het mogelijk maakt voor de identificatie van schimmel organismen in overdekte omgevingen die het meest waarschijnlijk door een werknemer¹¹worden ingeademd. Andere lucht samplers, met inbegrip van cycloon samplers, zijn beschikbaar op de markt die hebben de mogelijkheid om het verzamelen van deeltjes binnen het inadembare bereik (< 4 µm)^12,13met behulp van filters. In tegenstelling, scheidt de NIOSH tweetraps cycloon aërosol sampler schimmel soorten op basis van hun aërodynamische diameter in wegwerp, polypropyleen-buizen die onmiddellijk kunnen worden verwerkt voor downstream toepassingen¹⁴.

Het proces van extractie van genomic DNA en versterken van de schimmel ITS regio’s worden beschreven in dit protocol. De methoden van de extractie gepresenteerd hebben speciaal ontwikkeld voor de extractie van genomic DNA van schimmels en bacteriën, zoals veel commerciële kits cellen van zoogdieren, bacteriën, of specifiek gisten^{15 target}. De inleidingen gebruikt in deze studie zijn geselecteerd op basis van hun totale dekking van zowel de schimmel ITS 1en ITS 2 regio’s^4,5. Rangschikken van deze regio’s zorgt voor de vergelijking van vele dwarshelling ITS sequenties, met inbegrip van degenen die volgorde het ITS 1-gebied, het zijn 2 regio of ITS 1 zowel de ITS 2 regio’s. De schimmel diversiteit van lucht monsters verzameld in een overdekt instellen met behulp van die deze methoden worden getoond, onthulling van een aanzienlijk aantal sequenties geplaatst in de stammen ascomyceten en Basidiomycota evenals andere sequenties die behoren tot de minder dominante schimmel stammen, zoals Zygomycota. De brede diversiteit van schimmel sequenties geïdentificeerd met behulp van deze aanpak zou niet worden gevangen met behulp van traditionele gevaar identificatie methodologieën zoals teelt of microscopie. Sequentiebepaling van schimmel ITS regio’s biedt een verbeterde methode om te identificeren schimmel gevaren en zorgen voor een beter begrip van binnen- en beroepsmatige schimmel posities.