Utilizando el T-laberinto modificado para evaluar los resultados funcionales de la memoria después de un paro cardíaco
Summary
Este protocolo describe el uso de un T-laberinto modificado para evaluar memoria aprendizaje funcional en isquemia cerebral paro cardíaco inducido por asfixia.
Abstract
Fondo: Evaluación de leve a moderado deterioro cognitivo en un modelo de isquemia cerebral global (es decir, paro cardíaco) puede ser difícil debido a la mala locomoción después de la cirugía. Por ejemplo, ratas que se someten a procedimientos quirúrgicos y están sometidas al laberinto acuático de Morris pueden no ser capaces de nadar, anulando así el experimento.
Nuevo método: Establecimos un test de T-laberinto modificado comportamiento alternancia espontánea. La principal ventaja del protocolo modificado de T-laberinto es su diseño relativamente simple que es lo suficientemente potente como para evaluar la memoria de aprendizaje funcional tras la isquemia. Además, el análisis de datos es sencillo. Se utilizó la T-laberinto para determinar déficit de aprendizaje/memoria de las ratas en la presencia o ausencia de leve a moderada (6 min) asphyxial cardiaco (ACA). Las ratas tienen una tendencia natural para la exploración y explorarán los brazos alternos en la T-laberinto, mientras que las ratas hipocampales lesionados tienden a adoptar una preferencia de lado dando lugar a relaciones de alternancia espontánea disminuida, revelando el hipocampo relacionadas con el aprendizaje/memoria funcional en la presencia o ausencia de ACA.
Resultados: Grupos ACA tienen cocientes más altos de preferencia de lado y alteraciones menores en comparación con el control.
Comparación con los métodos existentes: Morris el agua y el laberinto de Barnes son más importantes para evaluar la función de aprendizaje/memoria. Sin embargo, el laberinto acuático de Morris es más estresante que otros laberintos. El laberinto de Barnes es ampliamente utilizado para medir la memoria de referencia (largo plazo), mientras que déficit neurocognitivo inducida por ACA está más estrechamente relacionadas con memoria (corto plazo) de trabajo.
CONCLUSIONES: Hemos desarrollado una estrategia simple pero eficaz para delinear el trabajo de memoria (a corto plazo) a través de la T-Laberinto en nuestro modelo de isquemia cerebral global (ACA).
Introduction
Según la Asociación Americana del corazón (2017), cardiaco (CA)-mortalidad inducida se produce cada cuatro minutos y afecta a más de 400.000 personas por año en los Estados Unidos1. Está bien documentado que el CA puede causar daño neuronal cerebral como consecuencia de sangre insuficiente perfusión2,3,4. Lesión cerebral inducida por CA se produce en la región sensible a la isquemia del CA1 del hipocampo5,6,7, que afecta a las neuronas que son fundamentales para el aprendizaje y la memoria de8,9, 10,11,12. Por otra parte, la pérdida de la densidad de la espina dorsal dendrítica, bajo condiciones isquémicas en el hipocampo (es decir, las neuronas CA1), desempeña un papel crítico en el deterioro de memoria espacial13,14,15. Debido a estos cambios patológicos después de CA, trastornos conductuales tales como: ansiedad, depresión, trastorno de estrés postraumático y pérdida de la memoria son más frecuentes. Aunque ha habido avances en la tecnología médica (es decir, eficiente servicio ambulatorio) que correlacionan con mejores tasas de supervivencia de CA, la mayoría de los tratamientos neuroprotectores (excepto hipotermia) no mejora los resultados funcionales después de CA16 ,17. Sobrevivientes de CA típicamente tienen una pobre calidad de vida y cargan incremental médicos gasto16.
Evaluaciones del estado cognitivo de isquemia cerebral por medio de pruebas de comportamiento son importantes para determinar la eficacia de ambas drogas y finalmente desarrollar un ensayo clínico exitoso. En la década de 1940, Edward Tolman diseñó el primer ensayo de comportamiento para estudiar la memoria espacial basado en el hipocampo18. Posteriormente, se desarrollaron diferentes laberintos (laberinto acuático de Morris, laberinto radial, T – o laberinto o laberinto de Barnes) para evaluar el aprendizaje espacial basado en el hipocampo y la memoria en ratas19,20,21,22 ,23. Uno de la prueba de comportamiento más ampliamente utilizada es el laberinto acuático de Morris, que examina el aprendizaje espacial y memoria en la rata modelos24. Sin embargo, el laberinto acuático de Morris requiere la rata para nadar y ejercer control y función motora completa. Para los experimentos de isquemia como el modelo de asphyxial cardiaco (ACA, un modelo de rata de CA), canulación de la vena/arteria femoral deben obtener vital presión arterial, gasometría arterial e introducción de varias drogas. Puesto que la canulación de la arteria femoral vena puede inhibir la movilidad de la pierna representación capacidad de rata a nadar correctamente, el laberinto acuático de Morris no puede ser el más apropiado para poner a prueba las debilitaciones cognoscitivas bajo ACA.
El laberinto de Barnes es la otra prueba conductual utilizada para examinar el aprendizaje espacial y memoria en modelos de roedores. El laberinto de Barnes no requiere el ejercicio de la función completa motor y control y por lo tanto menos estresante que el laberinto de agua de Morris. En el pasado, se realizaron experimentos con el laberinto de Barnes para determinar si las diferencias de aprendizaje/memoria funcional ocurren entre control o sham versus ratas inducidas por ACA. Los datos obtenidos por el laberinto de Barnes no tuvo resolución para probar las debilitaciones cognoscitivas después de leve a moderada ACA debido a que el laberinto de Barnes es ampliamente utilizado para medir la memoria de referencia (largo plazo)25,26, mientras que Déficits neurocognitivos ACA-inducida más estrechamente relacionados con el trabajo (corto plazo) memoria27,28,29,30 sugiriendo que el laberinto de Barnes es menos viable para evaluar la función de memoria en nuestro ACA modelo.
Así desarrollamos un T-laberinto modificado con prueba de alternancia espontánea para evaluar la memoria (a corto plazo) de trabajo después de ACA. Ventaja importante de prueba modificada de alternancia espontánea de T-laberinto es su simplicidad y mínimo estrés de las ratas en comparación con otras pruebas de comportamiento debido a que el T-laberinto modificado no requiere formación previa del animal, como bien como pesado computacional Análisis o subrutinas (es decir, imágenes de video de la rata) como lo requiere el laberinto acuático de Morris y el laberinto de Barnes. Aquí mostramos que la prueba modificada de la alternancia espontánea de T-laberinto es un paradigma ensayo conductual simple y sin embargo altamente eficiente que ofrece suficiente resolución para detectar con precisión y evaluar la función del hipocampo en las enfermedades que causan pérdida de memoria a corto plazo (es decir, ACA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Las modificaciones fueron hechas en el presente estudio en comparación con el diácono y los Rawlins protocolo31. La impresora 3D se utilizó para construir la T-laberinto. La impresión 3D proporciona alternativas asequibles y rentables para T-laberinto comercializado. Para reducir la ansiedad de ratas durante la prueba, el T-laberinto se realizó en el cuarto oscuro con iluminación mínima. Una vez que la rata de uno de los brazos de la meta, nos bloquearon suavemente el brazo opuesto. Esto ev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos de salud nacional Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular conceder 1R01NS096225-01A1, concede a la Asociación Americana del corazón AHA-13SDG1395001413, 17GRNT33660336 de AHA, AHA-17POST33660174, la Subvención de Universidad del estado de Louisiana en Consejo de investigación de ayuda, el Malcolm Feist beca de Investigación Cardiovascular y el Evelyn F. McKnight Brain Institute.
Materials
| 3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
| 3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
| 200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
| Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
| Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
| Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
| ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
| O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
| N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
| Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
| Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
| Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
| Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
| Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
| Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
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