Summary

Utilizando el T-laberinto modificado para evaluar los resultados funcionales de la memoria después de un paro cardíaco

Published: January 05, 2018
doi:

Summary

Este protocolo describe el uso de un T-laberinto modificado para evaluar memoria aprendizaje funcional en isquemia cerebral paro cardíaco inducido por asfixia.

Abstract

Fondo: Evaluación de leve a moderado deterioro cognitivo en un modelo de isquemia cerebral global (es decir, paro cardíaco) puede ser difícil debido a la mala locomoción después de la cirugía. Por ejemplo, ratas que se someten a procedimientos quirúrgicos y están sometidas al laberinto acuático de Morris pueden no ser capaces de nadar, anulando así el experimento.

Nuevo método: Establecimos un test de T-laberinto modificado comportamiento alternancia espontánea. La principal ventaja del protocolo modificado de T-laberinto es su diseño relativamente simple que es lo suficientemente potente como para evaluar la memoria de aprendizaje funcional tras la isquemia. Además, el análisis de datos es sencillo. Se utilizó la T-laberinto para determinar déficit de aprendizaje/memoria de las ratas en la presencia o ausencia de leve a moderada (6 min) asphyxial cardiaco (ACA). Las ratas tienen una tendencia natural para la exploración y explorarán los brazos alternos en la T-laberinto, mientras que las ratas hipocampales lesionados tienden a adoptar una preferencia de lado dando lugar a relaciones de alternancia espontánea disminuida, revelando el hipocampo relacionadas con el aprendizaje/memoria funcional en la presencia o ausencia de ACA.

Resultados: Grupos ACA tienen cocientes más altos de preferencia de lado y alteraciones menores en comparación con el control.

Comparación con los métodos existentes: Morris el agua y el laberinto de Barnes son más importantes para evaluar la función de aprendizaje/memoria. Sin embargo, el laberinto acuático de Morris es más estresante que otros laberintos. El laberinto de Barnes es ampliamente utilizado para medir la memoria de referencia (largo plazo), mientras que déficit neurocognitivo inducida por ACA está más estrechamente relacionadas con memoria (corto plazo) de trabajo.

CONCLUSIONES: Hemos desarrollado una estrategia simple pero eficaz para delinear el trabajo de memoria (a corto plazo) a través de la T-Laberinto en nuestro modelo de isquemia cerebral global (ACA).

Introduction

Según la Asociación Americana del corazón (2017), cardiaco (CA)-mortalidad inducida se produce cada cuatro minutos y afecta a más de 400.000 personas por año en los Estados Unidos1. Está bien documentado que el CA puede causar daño neuronal cerebral como consecuencia de sangre insuficiente perfusión2,3,4. Lesión cerebral inducida por CA se produce en la región sensible a la isquemia del CA1 del hipocampo5,6,7, que afecta a las neuronas que son fundamentales para el aprendizaje y la memoria de8,9, 10,11,12. Por otra parte, la pérdida de la densidad de la espina dorsal dendrítica, bajo condiciones isquémicas en el hipocampo (es decir, las neuronas CA1), desempeña un papel crítico en el deterioro de memoria espacial13,14,15. Debido a estos cambios patológicos después de CA, trastornos conductuales tales como: ansiedad, depresión, trastorno de estrés postraumático y pérdida de la memoria son más frecuentes. Aunque ha habido avances en la tecnología médica (es decir, eficiente servicio ambulatorio) que correlacionan con mejores tasas de supervivencia de CA, la mayoría de los tratamientos neuroprotectores (excepto hipotermia) no mejora los resultados funcionales después de CA16 ,17. Sobrevivientes de CA típicamente tienen una pobre calidad de vida y cargan incremental médicos gasto16.

Evaluaciones del estado cognitivo de isquemia cerebral por medio de pruebas de comportamiento son importantes para determinar la eficacia de ambas drogas y finalmente desarrollar un ensayo clínico exitoso. En la década de 1940, Edward Tolman diseñó el primer ensayo de comportamiento para estudiar la memoria espacial basado en el hipocampo18. Posteriormente, se desarrollaron diferentes laberintos (laberinto acuático de Morris, laberinto radial, T – o laberinto o laberinto de Barnes) para evaluar el aprendizaje espacial basado en el hipocampo y la memoria en ratas19,20,21,22 ,23. Uno de la prueba de comportamiento más ampliamente utilizada es el laberinto acuático de Morris, que examina el aprendizaje espacial y memoria en la rata modelos24. Sin embargo, el laberinto acuático de Morris requiere la rata para nadar y ejercer control y función motora completa. Para los experimentos de isquemia como el modelo de asphyxial cardiaco (ACA, un modelo de rata de CA), canulación de la vena/arteria femoral deben obtener vital presión arterial, gasometría arterial e introducción de varias drogas. Puesto que la canulación de la arteria femoral vena puede inhibir la movilidad de la pierna representación capacidad de rata a nadar correctamente, el laberinto acuático de Morris no puede ser el más apropiado para poner a prueba las debilitaciones cognoscitivas bajo ACA.

El laberinto de Barnes es la otra prueba conductual utilizada para examinar el aprendizaje espacial y memoria en modelos de roedores. El laberinto de Barnes no requiere el ejercicio de la función completa motor y control y por lo tanto menos estresante que el laberinto de agua de Morris. En el pasado, se realizaron experimentos con el laberinto de Barnes para determinar si las diferencias de aprendizaje/memoria funcional ocurren entre control o sham versus ratas inducidas por ACA. Los datos obtenidos por el laberinto de Barnes no tuvo resolución para probar las debilitaciones cognoscitivas después de leve a moderada ACA debido a que el laberinto de Barnes es ampliamente utilizado para medir la memoria de referencia (largo plazo)25,26, mientras que Déficits neurocognitivos ACA-inducida más estrechamente relacionados con el trabajo (corto plazo) memoria27,28,29,30 sugiriendo que el laberinto de Barnes es menos viable para evaluar la función de memoria en nuestro ACA modelo.

Así desarrollamos un T-laberinto modificado con prueba de alternancia espontánea para evaluar la memoria (a corto plazo) de trabajo después de ACA. Ventaja importante de prueba modificada de alternancia espontánea de T-laberinto es su simplicidad y mínimo estrés de las ratas en comparación con otras pruebas de comportamiento debido a que el T-laberinto modificado no requiere formación previa del animal, como bien como pesado computacional Análisis o subrutinas (es decir, imágenes de video de la rata) como lo requiere el laberinto acuático de Morris y el laberinto de Barnes. Aquí mostramos que la prueba modificada de la alternancia espontánea de T-laberinto es un paradigma ensayo conductual simple y sin embargo altamente eficiente que ofrece suficiente resolución para detectar con precisión y evaluar la función del hipocampo en las enfermedades que causan pérdida de memoria a corto plazo (es decir, ACA).

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron realizados de conformidad con los lineamientos de los institutos nacionales de salud y aprobados por el cuidado institucional de animales y uso (centro de Ciencias de la salud LSU-Shreveport) para el uso de () ratas macho Sprague Dawley 300-350 g, 9-10 semanas de edad). Las ratas se mantuvieron en ayuno durante la noche antes de la cirugía ACA. 1. configuración y diseño de aparatos de T-laberinto Nota: Base del diseño…

Representative Results

ACA (isquemia cerebral global) causa principalmente trabajo (corto plazo) los déficits de memoria28,29. Para evaluar la función del aprendizaje y la memoria después de ACA, se utilizó el test de alternancia espontánea modificada para evaluar el trabajo de memoria (a corto plazo)30. Los resultados del test de alternancia espontánea sugieren que la tasa de la alternancia de tres días consecutivos en el…

Discussion

Las modificaciones fueron hechas en el presente estudio en comparación con el diácono y los Rawlins protocolo31. La impresora 3D se utilizó para construir la T-laberinto. La impresión 3D proporciona alternativas asequibles y rentables para T-laberinto comercializado. Para reducir la ansiedad de ratas durante la prueba, el T-laberinto se realizó en el cuarto oscuro con iluminación mínima. Una vez que la rata de uno de los brazos de la meta, nos bloquearon suavemente el brazo opuesto. Esto ev…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos de salud nacional Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular conceder 1R01NS096225-01A1, concede a la Asociación Americana del corazón AHA-13SDG1395001413, 17GRNT33660336 de AHA, AHA-17POST33660174, la Subvención de Universidad del estado de Louisiana en Consejo de investigación de ayuda, el Malcolm Feist beca de Investigación Cardiovascular y el Evelyn F. McKnight Brain Institute.

Materials

3D Printer MakerBot Replicator Fifth generation
3D Printer Filament Hatchbox PLA, 1.75 mm filament diameter
200 Proof Pure Ethanol Koptec V1005SG
Sani-Chips PJ Murphy-Forest Products Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags
Rat Charles River Laboratories Sprague-Dawley
Vecuronium bromide Sun Pharmaceutical 47335-931-40 10 mg
Epinephrine Par Pharmaceutical 42023-103-01 Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000
Buprenorphine Hydrochloride Injection Pfizer 00409-2012-32 0.3mg/mL
SketchUp Trimble Inc. 3D modeling software
VentElite Small Animal Ventilator Harvard Apparatus 55-7040 Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg)
PowerLab 8/35 Adinstruments PL3508 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode.
Bio Amps Adinstruments FE132 The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings.
Quad Bridge Amp Adinstruments FE224 A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers.
LabChart 8 Adinstruments
ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer Radiometer pH / p CO2 / p O2
SURFLO Teflon I.V. Catheter Terumo sc-361556 Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long)
Pipet/Infusion Needle Hamilton 7748-03 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle
Classic T3 Vaporizer SurgiVet VCT302 Classic T3 Isoflurane Funnel Fill
ENVIRO-PURE Charcoal Canister SurgiVet 32373B10 Designed to absorb waste anesthetic gas
O2 single flowmeter SurgiVet 32375B1 0-1000 mL
N2O Flowmeter VetEquip 401721 0-4LPM
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) Becton Dickinson 427565 23 gauge
Micro Forceps Black and Black surgical B3FRC-18 RM-8 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved.
Halstead Mosquito Forceps Roboz RS-7111 Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width
Mixter Forceps Roboz RS-7291 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips
Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5650 Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length
Mayo-Stille Scissors Roboz RS-6891 5.5" Round Curved
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm
Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder Roboz RS-7884 Cross Serration Tip; 5.5" Length
Moloney Forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length

References

  1. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
  2. Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. Resuscitation. 25, 171-179 (1993).
  3. Kim, Y. J., et al. Long-term neurological outcomes in patients after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 101, 1-5 (2016).
  4. Earnest, M. P., Yarnell, P. R., Merrill, S. L., Knapp, G. L. Long-term survival and neurologic status after resuscitation from out-of-hospital cardiac arrest. Neurology. 30, 1298-1302 (1980).
  5. Cerchiari, E. L., Safar, P., Klein, E., Cantadore, R., Pinsky, M. Cardiovascular function and neurologic outcome after cardiac arrest in dogs. The cardiovascular post-resuscitation syndrome. Resuscitation. 25, 9-33 (1993).
  6. Petito, C. K., Feldmann, E., Pulsinelli, W. A., Plum, F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology. 37, 1281-1286 (1987).
  7. Schmidt-Kastner, R., Freund, T. F. Selective vulnerability of the hippocampus in brain ischemia. Neuroscience. 40, 599-636 (1991).
  8. Corkin, S. What’s new with the amnesic patient H.M.?. Nat Rev Neurosci. 3, 153-160 (2002).
  9. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. 1957. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 12, 103-113 (2000).
  10. Smith, T. D., Calhoun, M. E., Rapp, P. R. Circuit and morphological specificity of synaptic change in the aged hippocampal formation. Neurobiol Aging. 20, 357-358 (1999).
  11. Gage, F. H., Dunnett, S. B., Bjorklund, A. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol Aging. 5, 43-48 (1984).
  12. Tulving, E., Markowitsch, H. J. Episodic and declarative memory: role of the hippocampus. Hippocampus. 8, 198-204 (1998).
  13. Neigh, G. N., et al. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci. 20, 1865-1872 (2004).
  14. Volpe, B. T., Davis, H. P., Towle, A., Dunlap, W. P. Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions. Behav Neurosci. 106, 457-464 (1992).
  15. Astur, R. S., Taylor, L. B., Mamelak, A. N., Philpott, L., Sutherland, R. J. Humans with hippocampus damage display severe spatial memory impairments in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 132, 77-84 (2002).
  16. Lee, R. H., et al. Fatty acid methyl esters as a potential therapy against cerebral ischemia. OCL. 23, D108 (2016).
  17. Lee, R. H., Porto, L. F., et al. Chapter 1. Palmitic acid: occurrence, biochemistry and health effects. , 1-15 (2014).
  18. Tolman, E. C., Gleitman, H. Studies in spatial learning; place and response learning under different degrees of motivation. J Exp Psychol. 39, 653-659 (1949).
  19. Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79, 683-693 (2003).
  20. Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Psychol. 93, 74-104 (1979).
  21. Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203, 151-164 (2009).
  22. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55, 310-332 (2014).
  23. Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H. Assessment of spatial memory in mice. Life Sci. 87, 521-536 (2010).
  24. Poon, T. P., et al. Spinal cord toxoplasma lesion in AIDS: MR findings. J Comput Assist Tomogr. 16, 817-819 (1992).
  25. Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nat Protoc. 390, (2007).
  26. Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice. J Vis Exp. , (2012).
  27. Seeger, T., et al. M2 muscarinic acetylcholine receptor knock-out mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
  28. Olton, D. S., Feustle, W. A. Hippocampal function required for nonspatial working memory. Exp Brain Res. 41, 380-389 (1981).
  29. Hayashida, K., et al. Hydrogen inhalation during normoxic resuscitation improves neurological outcome in a rat model of cardiac arrest independently of targeted temperature management. Circulation. 130, 2173-2180 (2014).
  30. Dember, W. N., Richman, C. L. . Spontaneous alternation behavior. , (1989).
  31. Deacon, R. M., Rawlins, J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature protocols. 1, 7-12 (2006).
  32. Wong, K. V., Hernandez, A. A review of additive manufacturing. ISRN Mechanical Engineering. 2012, (2012).
  33. Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171, 566-576 (2010).
  34. Lin, H. W., et al. Fatty acid methyl esters and Solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 5, 109-117 (2014).
  35. Lee, R. H., et al. Interruption of perivascular sympathetic nerves of cerebral arteries offers neuroprotection against ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 312, H182-H188 (2017).
  36. Bali, Z. K., et al. Differential effects of alpha7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res. 278, 404-410 (2015).
  37. McDonald, J. H. . Handbook of biological statistics. 2, (2009).
  38. Castellano, M. A., Diaz-Palarea, M. D., Rodriguez, M., Barroso, J. Lateralization in male rats and dopaminergic system: evidence of right-side population bias. Physiol Behav. 40, 607-612 (1987).
  39. Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., Suresh Chandra, J. Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods. 110, 31-35 (2001).

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Cite This Article
Wu, C. Y. C., Lerner, F. M., Couto e Silva, A., Possoit, H. E., Hsieh, T., Neumann, J. T., Minagar, A., Lin, H. W., Lee, R. H. C. Utilizing the Modified T-Maze to Assess Functional Memory Outcomes After Cardiac Arrest. J. Vis. Exp. (131), e56694, doi:10.3791/56694 (2018).

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