Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales
Summary
Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.
Abstract
Los macrófagos son las células inmunes innatas fagocíticas, que inician la respuesta inmune a patógenos y contribuyan a la restitución del tejido y cicatrización. Los macrófagos son igualmente importantes en la desactivación de las respuestas inflamatorias. Hemos demostrado que los macrófagos estimulados con inmunoglobulina intravenosa (IgIV) pueden producir altas cantidades de la citocina antiinflamatoria, interleucina 10 (IL-10) y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias en respuesta a los lipopolisacáridos bacterianos ( LPS). IVIg es que un anticuerpo polivalente, principalmente inmunoglobulina Gs (IgGs), agrupados desde el plasma de más de 1.000 donantes de sangre. Se utiliza para complementar los anticuerpos en pacientes con inmunodeficiencias o para suprimir la respuesta inmune en pacientes con enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Infliximab, un factor terapéutico antifactor de necrosis tumoral alfa (TNFα) anticuerpo, también se ha demostrado para activar a los macrófagos a producir IL-10 en respuesta a estímulos inflamatorios. Inmunoglobulina intravenosa y otros productos biológicos basados en anticuerpos pueden analizarse para determinar sus efectos sobre la activación de los macrófagos. Este artículo describe métodos para la derivación, la estimulación y la evaluación de los macrófagos de médula ósea murina activados por los anticuerpos en vitro y macrófagos peritoneales murinos activados con anticuerpos in vivo. Por último, se demuestra el uso de western blot para determinar la contribución de la señalización de caminos hacia la actividad de los macrófagos antiinflamatorios específicos de la célula. Estos protocolos se pueden utilizar con ratones genéticamente modificados, para determinar el efecto de una proteína específica sobre la activación de macrófagos antiinflamatorio. Estas técnicas pueden usarse para evaluar si determinados productos biológicos pueden actuar cambiando los macrófagos a un estado de activación antiinflamatorio de producción de IL-10 que reduce las respuestas inflamatorias en vivo. Esto puede proporcionar información sobre el papel de la activación de los macrófagos en la eficacia de productos biológicos en modelos de la enfermedad en ratones y proporcionar la penetración en un nuevo mecanismo de potenciales de acción en las personas. Por el contrario, esto puede precaución contra el uso de productos biológicos basados en anticuerpos específicos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente si los macrófagos juegan un papel importante en la defensa del huésped contra la infección por esa.
Introduction
Los macrófagos son las células inmunes innatas, que desempeñan múltiples roles en la respuesta inmune a infección o lesión. Los macrófagos son responsables de iniciar una respuesta inmunitaria a la infección o tejido, deteniendo la respuesta inflamatoria y promover la curación de respuesta1. Ejemplos de los tres Estados de activación del macrófago mejor estudiados son: 1) los macrófagos tratados con interferón gamma (IFNγ) y bacteriano lipopolysaccharide (LPS), señalado M (IFNγ + LPS), que contribuyen a la respuesta inflamatoria; 2) macrófagos estimulados con interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), que se asocian con la respuesta de curación; 3) macrófagos estimulados con complejos inmunes (CI) y LPS, M (IC + LPS), que tienen la capacidad para apagar la respuesta inflamatoria2,3. M (IC + LPS) son distinto de los macrófagos de la cicatrización M(IL-4) y no expresan la arginasa (Arg-1) de la enzima o FIZZ14. El mejor marcador para estos macrófagos antiinflamatorios es la producción del cytokine del5. Los macrófagos tienen múltiples funciones en el mantenimiento de la salud, pero también contribuyan a enfermedades inflamatorias y cáncer3. Por esta razón, los macrófagos son una diana terapéutica clave para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. Es importante investigar los efectos de los anticuerpos sobre su estado de activación para desarrollar tratamientos a base de macrófagos para la enfermedad.
El enfoque de este artículo es sobre el uso de macrófagos murinos la médula ósea derivado (BMDMs) y los macrófagos peritoneales para probar el efecto de fármacos de anticuerpos en las respuestas inflamatorias in vitro e in vivo. Recientemente, ha habido varios estudios que demuestran los efectos de anticuerpos macrófago activación6,7,8. Macrófagos activados conjuntamente con complejos inmunes, que son anticuerpos complejados con un antígeno y LPS, un estímulo inflamatorio normalmente, producen niveles muy altos de la citocina antiinflamatoria IL-10 y niveles muy bajos de la citocina proinflamatoria, Interleucina 12 (IL-12)9. Además, infliximab, un anticuerpo monoclonal contra el TNFα, se ha encontrado para trabajar, en parte, mediante la inducción de macrófagos antiinflamatorios a través de su fragmento cristalizable (Fc) región7. Nos han informado que la IgIV + LPS inducen activación de macrófagos antiinflamatorio similar a M (IC + LPS), en donde co estimulados macrófagos producen grandes cantidades de IL-10 y cantidades bajas de la subunidad de citoquinas pro-inflamatorias interleuquina 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleucina 6 (IL-6) y TNF8. Inmunoglobulina intravenosa es un fármaco compuesto de anticuerpos policlonales, principalmente IgG, que ha sido de la sangre de los donantes más de 1.00010. Se utiliza para tratar una amplia variedad de Enfermedades inmunológicas, como la púrpura trombocitopénica idiopática y la polineuropatía desmielinizante crónica, pero su mecanismo de acción no es completamente entendida11. Los efectos de drogas de anticuerpos basados en la activación de los macrófagos pueden ser evaluados mediante los métodos descritos en este documento.
Los efectos de productos biológicos específicos en la activación de los macrófagos se pueden probar en BMDMs y en los macrófagos peritoneales. Utilizando estas fuentes de macrófagos permite la evaluación de células primarias. Pruebas preliminares de anticuerpos en cultivos de células primarias requiere menos tiempo y la inversión monetaria que otros modelos de enfermedad desperdiciador de tiempo y costoso. Por inyectar un medicamento en un ratón sano en vivoy aislar las células y análisis ex vivo, uno puede determinar si los estudios están garantizados para evaluar si el tratamiento con productos biológicos afecta la activación de los macrófagos en modelos de la enfermedad.
Con pocos estudios el efecto de las terapias biológicas en la activación de macrófagos in vitro e in vivo la prueba directamente, nuestras técnicas proporcionan una ventaja sobre técnicas alternativas. Las técnicas actuales implican efectos de droga biológica prueba de mezclado de la célula poblaciones en vitro, por ejemplo el efecto de infliximab en una reacción linfocitaria mixta (MLR) o inmunoglobulina intravenosa en macrófagos humanos en células mononucleares de sangre periférica, donde el efecto no se puede atribuir a una célula específica tipo7,12. Uso de BMDMs y macrófagos peritoneales es ventajoso sobre el uso de líneas celulares, tales como 264.7 células, que no producen las citoquinas pro inflamatorias, IL-12, en respuesta a LPS8,13. Prueba el efecto de una droga basada en anticuerpos en macrófago respuestas ex vivo tiene ventajas porque las respuestas del cytokine pueden atribuirse directamente a los macrófagos, en lugar de inferir las respuestas de los macrófagos mediante la medición de niveles del cytokine del suero14 . BMDMs y macrófagos peritoneales pueden ser derivados y aislados de ratones modificados genéticamente para determinar el papel específico de una proteína de activación de los macrófagos antiinflamatorio. Por ejemplo, hemos utilizado Il10 deficiente(- / –) BMDMs para demostrar que la reducción inducida por la inmunoglobulina intravenosa de la producción de citoquinas pro-inflamatorias es parcialmente dependiente de IL-108. Mecanismo de un medicamento de acción puede ser investigado utilizando el borrar occidental, donde el papel de proteínas específicas y eventos de señalización puede ser determinado. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) puede realizarse en BMDMs o los macrófagos peritoneales muestran patrones de expresión génica que resultan de la activación de anticuerpos. Modelos de la enfermedad en ratones pueden proporcionar información sobre la potencial eficacia de las terapias biológicas basados en anticuerpos en modelos para enfermedades como la inflamatoria intestinal enfermedad de, artritis reumatoide y cáncer15,16, 17. sin embargo, las técnicas descritas aquí proporcionará información sobre el mecanismo de acción de estos productos biológicos determinando si inducen la actividad de los macrófagos antiinflamatorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estados de activación del macrófago juegan un papel importante en tanto tejido homeostasis y enfermedad22. Los macrófagos pueden tener distintas así como superposición de Estados de activación, dependiendo de señales en su microentorno3. Ellos tienen diferentes roles en todas las etapas de la respuesta inflamatoria: defensa contra agentes patógenos, restitución del tejido y cicatrización de la herida, y también tienen un estado de activación antiinflamatorio dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.K. es el recipiente de la concesión de beca posgrado beca de 4 años (4YF) Universidad de British Columbia. L.M.S. es el destinatario de una Asociación canadiense de Gastroenterología / de Crohn y de Colitis de Canadá / Premio CIHR nuevo salario del investigador y es un erudito Biomédica de la Fundación de Michael Smith para la investigación en salud. Este trabajo fue financiado por una subvención de proyecto de Canadian Blood Services, en colaboración con los institutos de salud de investigación de Canadá (concesión # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
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