Оценки воздействия наркотиков на основе антител на мышиных костного мозга и перитонеальных макрофагов активации
Summary
Препараты на основе антител революционизировал лечения воспалительных заболеваний. Помимо непосредственного воздействия на конкретные цели, антитела могут активировать макрофаги стать противовоспалительное. Этот протокол описывает как противовоспалительное макрофагов активации может быть начисленных в пробирке, с помощью мыши костного макрофагов и в естественных условиях, используя перитонеальных макрофагов.
Abstract
Макрофаги являются фагоцитирующих врожденные иммунные клетки, которые инициируют иммунных реакций к патогенам и содействовать реституции исцеления и ткани. Макрофаги одинаково важны в отключение воспалительных реакций. Мы показали, что макрофаги стимулируется с внутривенного иммуноглобулина (IVIg) может производить большое количество противовоспалительных цитокинов, интерлейкин-10 (IL-10) и низкий уровень провоспалительных цитокинов в ответ (бактериальных липополисахаридов LPS). IVIg является поливалентная антитела, главным образом иммуноглобулина Gs (IgGs), пул из плазмы крови доноров, более чем 1000. Он используется для дополнения антител у больных с нарушениями иммунной или для подавления иммунной реакции у больных аутоиммунным или воспалительные условий. Также было показано, что инфликсимаб, терапевтические противоопухолевый некроза фактор альфа (TNFα) антител, активация макрофагов для производства Ил-10 в ответ на раздражители, воспалительные. IVIg и другие биопрепаратов на основе антител может испытываться для определения их воздействия на активацию макрофага. Этот документ описывает методы деривации, стимуляции и оценки мышиных костного Макрофаги активируются антител в пробирке и мышиных перитонеальных макрофагов, активированный с антител в естественных условиях. Наконец мы продемонстрировать использование Западный blotting для определения вклада конкретных ячеек, сигнальные пути противовоспалительные макрофагов деятельности. Эти протоколы могут использоваться с мышами, генетически модифицированных, для определения влияния конкретных белки на противовоспалительные макрофагов активации. Эти методы могут также использоваться для оценки ли конкретные биопрепаратов может действовать, изменив макрофагами IL-10-производство противовоспалительных активации государству, которое снижает воспалительные реакции в естественных условиях. Это может предоставить информацию о роли активации макрофагов в эффективность биопрепаратов во время болезни модели мышей и обеспечить понимание потенциальный новый механизм действий в людей. Наоборот это может предостеречь против использования конкретных биопрепаратов на основе антител для лечения инфекционных заболеваний, особенно если макрофаги играют важную роль в принимающей обороны против этой инфекции.
Introduction
Макрофаги являются врожденные иммунные клетки, которые играют многогранную роль в иммунной реакции на инфекции или травмы. Макрофаги являются ответственность за инициирование иммунного ответа на инфекцию или ткани ущерб, остановить воспалительный процесс и содействие исцеления ответ1. Примерами трех лучших изученных макрофагов активации государств являются: 1) макрофагов, относились с гамма-интерферона (IFNγ) и бактериальных липополисахарида (LPS), Места для М (IFNγ + ПЛАСТИНКИ), которые способствуют воспалительный процесс; 2) стимулируется с интерлейкинов 4 (Ил-4), M(IL-4), макрофаги, связанные с исцеления ответ; 3) макрофаги стимулируется с иммунных комплексов (ИК) и ЛПС, M (IC + ПЛАСТИНКИ), которые имеют возможность отключения воспалительной реакции2,3. M (IC + LPS) отличаются от M(IL-4) заживления макрофагов и не выразить фермента arginase (Arg-1) или FIZZ14. Лучшие маркер для этих противовоспалительные макрофагов является их производство цитокинов5. Макрофаги иметь несколько ролей в поддержании здоровья, но также способствовать воспалительных заболеваний и рака3. Из-за этого макрофаги являются ключевых терапевтических мишенью для лечения широкого спектра заболеваний. Важно исследовать эффекты антител на их состояние активации развивать Макрофаг основе лечения болезни.
Этот документ посвящен использованию мышиных костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) и перитонеальные макрофаги проверить влияние наркотиков антител на воспалительные реакции в пробирке и в естественных условиях. Недавно было несколько исследований, показывающих эффекты антител на макрофагов активации6,,78. Макрофаги, совместно активированный с иммунных комплексов, которые являются антитела complexed антигена, и LPS, обычно воспалительных стимул, производят очень высокий уровень противовоспалительных цитокинов, Ил-10 и очень низкий уровень провоспалительных цитокинов, интерлейкина 12 (IL-12)9. Кроме того, инфликсимаб, моноклональные антитела против TNFα было установлено на работу, в части, побуждая противовоспалительные макрофаги через кристаллизующихся региона (Fc) его фрагмент7. Мы уже сообщали, что IVIg + LPS побудить противовоспалительные макрофагов активации, которая похожа на М (IC + ПЛАСТИНОК), которой совместно стимулировать макрофаги производят большое количество Ил-10 и низкое количество провоспалительных цитокинов Субблок интерлейкина 12 или 23 p40 ( IL-12/23p40), интерлейкина-6 (IL-6) и ФНО8. IVIg – это препарат, состоящий из поликлональных антител, главным образом IgG, который были объединены из крови более чем 1000 доноров10. Он используется для лечения широкий спектр иммунологических заболеваний, таких как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хронический демиелинизирующий полинейропатия, однако механизм его действия является не полностью понял11. Влияние препаратов на основе антител на активацию макрофага можно оценить с помощью методов, описанных здесь.
Влияние конкретных биопрепаратов на активацию макрофага можно протестировать в BMDMs и перитонеальных макрофагов. Использование этих источников макрофагов позволяет оценки начальной клеток. Предварительного тестирования антител на культивируемых клеток первичного требует меньше времени и денежных инвестиций, чем другие модели трудоемким и дорогим болезни. Инъекционных наркотиков в здоровой мыши в естественных условияхи изоляция клетки и анализируя их ex vivo, можно определить, если исследования необходимы для оценки ли лечение с biologics влияет активация макрофагов в модели заболеванием.
С несколько исследований, непосредственно тестирование влияния биологических методов лечения на активации макрофагов в пробирке и в естественных условиях наши методы обеспечивают преимущество над альтернативные методы. Современные методы включают тестирования биологических наркотиков эффекты на смешанных клеток населения в пробирке, например эффект инфликсимаба в смешанных лимфоцитов реакции (MLR) или IVIg на человека макрофагов в мононуклеарных клеток периферической крови, где эффект нельзя отнести к определенной ячейке тип7,12. С помощью BMDMs и перитонеальные макрофаги выгодно над использованием клеточных линий, таких как RAW264.7 клетки, которые не производят провоспалительных цитокинов, Ил-12, в ответ на LPS8,13. Влияние препарата на основе антител на макрофагов ответов ex vivo тестирование имеет преимущества, потому что цитокина ответы можно отнести непосредственно макрофагов, вместо того, чтобы выведение ответы макрофагов, измеряя уровни цитокина сыворотки14 . BMDMs и перитонеальных макрофагов могут быть получены и изолированы от генетически модифицированных мышей, чтобы определить конкретную роль белка в активации противовоспалительные макрофагов. Например, мы использовали Il10 несовершенным(- / –) BMDMs продемонстрировать, что ВВИГ индуцированной снижение производства провоспалительных цитокинов частично зависит от Ил-108. Механизм действия препарата могут быть исследованы с помощью Западный blotting, где роль специфических белков и сигнализации событий может быть определена. Количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут выполняться на BMDMs или перитонеальных макрофагов, чтобы показать закономерности экспрессии генов в результате активации антитела. Заболевание модели мышей может предоставить информацию о потенциальной эффективности на основе антител биологической терапии в модели для таких болезней как воспалительных кишечника болезнь, ревматоидный артрит и рака15,16, 17. Однако, описанные здесь методы представит информацию о механизме действия этих биопрепаратов путем определения ли они побудить противовоспалительные макрофагов деятельность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Макрофагов активации государства играют важную роль в обеих ткани гомеостаза и болезни22. Макрофаги могут иметь собственный, а также перекрытие активации государства, в зависимости от сигналов в их микроокружения3. Они имеют различные роли на всех стадиях восп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Л.к. является получателем премии выпускник студенчества стипендий (4YF) 4-летнего университета Британской Колумбии. L.M.S. является получателем Канадская ассоциация гастроэнтерологии / крона и колит Канада / КНИИЗ новый следователь оклад премии и биомедицинских ученый Майкл Смит фонда для исследований в области здравоохранения. Эта работа была поддержана грантом проекта от Канадской службы крови, в сотрудничестве с канадской институтов медицинских исследований (Грант # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
