Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais
Summary
Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.
Abstract
Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas fagocíticas, iniciar respostas imunes a agentes patogénicos e contribuir para a restituição de cura e de tecido. Os macrófagos são igualmente importantes em desligar respostas inflamatórias. Mostramos que os macrófagos estimulados com imunoglobulina intravenosa (IVIg) podem produzir grandes quantidades das citocinas anti-inflamatórias, interleucina 10 (IL-10) e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias em resposta a lipopolissacarídeo bacteriano ( LPS). IVIg é que um anticorpo polivalente, principalmente imunoglobulina Gs (IgGs), pool de plasma de mais de 1.000 doadores de sangue. É usado para complementar os anticorpos em pacientes com deficiências imunológicas ou suprimir a resposta imune em pacientes com doenças auto-imunes ou inflamatórias. Infliximab, um anticorpo de alfa (TNFa) terapêutica anti-tumor necrose fator, também foi mostrado para ativar os macrófagos a produzir IL-10 em resposta a estímulos inflamatórios. IVIg e outros produtos biológicos baseados em anticorpo podem ser testados para determinar seus efeitos na ativação de macrófagos. Este artigo descreve métodos para derivação, estimulação e avaliação de medula murino macrófagos ativados por anticorpos em vitro e macrófagos peritoneais murino, ativados com anticorpos em vivo. Finalmente, vamos mostrar o uso da mancha ocidental para determinar a contribuição da célula específica, sinalização de caminhos para a atividade do macrófago anti-inflamatórios. Esses protocolos podem ser usados com ratos geneticamente modificados, para determinar o efeito de um somáticas específicas na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para avaliar se os produtos biológicos específicos podem agir alterando os macrófagos para um estado de ativação anti-inflamatórias IL-10-produzindo que reduz respostas inflamatórias em vivo. Isso pode fornecer informações sobre o papel da ativação de macrófagos na eficácia de produtos biológicos durante modelos de doenças em camundongos e fornecer informações sobre um novo mecanismo de potencial de ação nas pessoas. Por outro lado, isto pode advertir contra o uso de produtos biológicos de baseados em anticorpos específicos para tratar doenças infecciosas, particularmente se os macrófagos desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra a infecção.
Introduction
Os macrófagos são células do sistema imunológico inatas, que desempenham várias funções na resposta imune à infecção ou lesão. Os macrófagos são responsáveis por iniciar uma resposta imune a danos de infecção ou tecido, parando a resposta inflamatória e promover a cura de resposta1. Exemplos dos três Estados-ativação melhor estudados macrófago são: 1) macrófagos tratados com interferon gama (relato) e bacteriano lipopolissacarídeo (LPS), designado M (relato + LPS), que contribuem para a resposta inflamatória; 2) macrófagos estimulados com interleucina 4 (IL-4), M(IL-4), que são associados com a resposta de cura; 3) macrófagos estimulados com complexos imunes (IC) e LPS, M (IC + LPS), que têm a capacidade de desligar a resposta inflamatória2,3. M (IC + LPS) são distinto dos macrófagos de cicatrização de feridas M(IL-4) e não expressam a arginase enzima (Arg-1) ou FIZZ14. O melhor marcador para estes macrófagos anti-inflamatórios é a produção de citocinas5. Os macrófagos têm várias funções na manutenção da saúde, mas também contribuam para doenças inflamatórias e câncer3. Por causa disso, os macrófagos são um chave alvo terapêutico para o tratamento de uma ampla variedade de doenças. É importante investigar os efeitos dos anticorpos sobre seu estado de ativação para desenvolver tratamentos baseados em macrófagos para doença.
O foco deste artigo é sobre o uso de murino medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs) e macrófagos peritoneais para testar o efeito de drogas de anticorpo em respostas inflamatórias em vitro e em vivo. Recentemente, tem havido vários estudos mostrando os efeitos dos anticorpos na ativação de macrófagos a6,7,8. Macrófagos ativados conjuntamente com complexos imunes, que são anticorpos complexos com um antígeno e LPS, um estímulo inflamatório normalmente, produzem níveis muito elevados de citocinas anti-inflamatórias, IL-10 e níveis muito baixos das citocinas pró-inflamatórias, Interleucina 12 (IL-12)9. Além disso, infliximab, um anticorpo monoclonal contra TNFa, verificou-se a trabalhar, em parte, através da indução de anti-inflamatórios macrófagos através de seu fragmento cristalizável (Fc) região7. Informamos que IVIg + LPS induzem ativação de macrófagos anti-inflamatório que é semelhante a M (IC + LPS), onde os macrófagos co estimulados produzem grandes quantidades de IL-10 e quantidades baixas da subunidade de citocina pró-inflamatória interleucina 12 ou 23 p40 ( Il-12/23p40), interleucina-6 (IL-6) e TNF8. IVIg é um fármaco composto por Anticorpos policlonais, principalmente IgG, que tem sido em pool de sangue de mais de 1.000 doadores10. Ele é usado para tratar uma ampla variedade de doenças imunológicas, tais como Púrpura Trombocitopênica Idiopática e polineuropatia desmielinizante crônica, mas seu mecanismo de ação não é completamente compreendido,11. Os efeitos das drogas do anticorpo com base na ativação de macrófagos podem ser avaliados usando os métodos descritos neste documento.
Os efeitos de produtos biológicos específicos na ativação de macrófagos podem ser testados em BMDMs e macrófagos peritoneais. Usar essas fontes macrófago permite avaliação de células primárias. Testes preliminares de anticorpos em culturas primárias de células requer menos tempo e investimento monetário do que outros modelos de doença demorado e caro. Injetar uma droga em um rato saudável na vivoe isolando as células e analisando-os ex vivo, pode-se determinar se os estudos são garantidos para avaliar se o tratamento com produtos biológicos afeta a ativação de macrófagos em modelos de doenças.
Com alguns estudos que testam o efeito das terapias biológicas na ativação de macrófagos in vitro e em vivo diretamente, nossas técnicas fornecem uma vantagem sobre técnicas alternativas. As técnicas atuais envolvem testes efeitos de drogas biológicas na célula mista populações em vitro, tais como o efeito de infliximab em uma reação linfocitária mista (MLR) ou IVIg em macrófagos humanos em células mononucleares do sangue periférico, onde o efeito Não pode ser atribuída a um tipo de célula específica7,12. Usar BMDMs e macrófagos peritoneais é vantajoso sobre usando linhas de células, como células RAW264.7, que não produzem a citocinas pró-inflamatórias, IL-12, em resposta a LPS8,13. Testar o efeito de uma droga baseada em anticorpos no macrófago respostas ex vivo tem vantagens porque o cytokine respostas podem ser atribuídas diretamente aos macrófagos, ao invés de inferir respostas macrófago medindo os níveis séricos de citocinas14 . BMDMs e macrófagos peritoneais podem ser derivados e isolados de ratos geneticamente modificados para determinar o papel específico de uma proteína na ativação de macrófagos anti-inflamatórios. Por exemplo, nós usamos Il10 deficiente(- / –) BMDMs para demonstrar que IVIg-induzido redução da produção de citocinas pró-inflamatórias é parcialmente dependente da IL-108. Mecanismo de uma droga de ação pode ser investigado usando mancha ocidental, onde o papel de proteínas específicas e sinalização de eventos pode ser determinado. Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) podem ser executada em BMDMs ou macrófagos peritoneais para mostrar os padrões de expressão gênica que resultam da ativação de anticorpos. Modelos de doenças em camundongos podem fornecer informações sobre a potencial eficácia de terapias biológicas anticorpo-baseado em modelos para as doenças inflamatórias intestinais doenças, artrite reumatoide e câncer15,16, 17. no entanto, as técnicas descritas aqui irão fornecer informações sobre o mecanismo de ação destes produtos biológicos, determinando se eles induzem a atividade do macrófago anti-inflamatórios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estados de ativação de macrófagos desempenham um papel importante em ambos de homeostase e doença do tecido22. Os macrófagos podem ter distintas bem como sobreposição de Estados de ativação, dependendo de pistas em seu microambiente3. Eles têm papéis distintos em todas as fases da resposta inflamatória: defesa contra patógenos, ferida restituição cura e tecido, e também tem um estado de ativação anti-inflamatórios distintos que é importante para desligar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.K. é o destinatário do prêmio bolsa de estudo de pós-graduação da Universidade da Colúmbia Britânica comunhão 4-ano (4YF). LMS é o destinatário de uma associação canadense de Gastroenterologia / Crohn e colite Canadá / CIHR novo investigador salário prêmio e é um estudioso biomédicas da Fundação de Michael Smith para pesquisa em saúde. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto da canadense serviços de sangue, em colaboração com o canadense institutos de pesquisa em saúde (conceder # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
