Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung
Summary
Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.
Abstract
Makrophagen sind phagocytic angeborene Immunzellen, die Immunantworten auf Krankheitserreger zu initiieren und zu Heilung und Gewebe Wiedergutmachung beitragen. Makrophagen sind ebenso wichtig für die Entzündungsreaktionen ausschalten. Wir haben gezeigt, dass hohe Mengen an die Anti-inflammatorische Zytokine, Interleukin 10 (IL-10) und niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf bakteriellen Lipopolysacchariden (Makrophagen stimuliert mit intravenösem Immunglobulin (IVIg produzieren) LPS). IVIg ist ein polyvalenter Antikörper, vor allem Immunglobulin Gs (IgGs), aus dem Plasma von mehr als 1.000 Blutspendern gebündelt. Es dient der Ergänzung Antikörper bei Patienten mit Immunschwäche oder Immunantworten bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Bedingungen zu unterdrücken. Infliximab, eine therapeutische anti-Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) Antikörper, nachweislich auch Makrophagen produzieren IL-10 in Reaktion auf entzündliche Reize zu aktivieren. IVIg und andere Antikörper-basierten Biologics kann getestet werden, um deren Auswirkungen auf Makrophagen Aktivierung zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung, Stimulation und Bewertung der murinen Knochenmark Makrophagen durch Antikörper in Vitro aktiviert und murinen peritonealen Makrophagen aktiviert mit Antikörpern in Vivo. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von westliche Beflecken, um den Beitrag der bestimmte Zelle Signalwege entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität zu bestimmen. Diese Protokolle können mit genetisch veränderten Mäusen, verwendet werden, um festzustellen, die Wirkung von bestimmten benutzt auf entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung. Diese Techniken können auch verwendet werden, um festzustellen, ob bestimmte Biologics wirken können, indem Makrophagen auf eine IL-10 produzierende entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die Entzündungsreaktionen in Vivoreduziert. Dies kann geben Auskunft über die Rolle der Makrophagen Aktivierung in die Wirksamkeit von Biologika während Krankheitsmodelle in Mäusen und geben Einblick in ein potenzieller neuer Wirkmechanismus im Menschen. Umgekehrt kann dies gegen den Einsatz von spezifischen Antikörpern basierende Biologics Vorsicht zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere dann, wenn Makrophagen eine wichtige Rolle in der Wirt Verteidigung gegen diese Infektion spielen.
Introduction
Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die mehrere Rollen in der Immunantwort auf Infektionen oder Verletzungen zu spielen. Makrophagen sind verantwortlich für die Einleitung einer Immunantwort auf Infektionen oder Gewebe Schaden, die entzündliche Reaktion zu stoppen und die heilende Antwort1zu fördern. Beispiele für die drei am besten untersuchten Makrophagen Aktivierung Zustände sind: 1) Makrophagen, die Behandlung mit Interferon-Gamma (IFNγ) und bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), M (IFNγ + LPS) bezeichnet, die dazu beitragen, die entzündliche Reaktion; (2) Makrophagen stimuliert mit Interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), die mit dem Heilungsprozess verbunden sind; (3) Makrophagen stimuliert mit Immunkomplexe (IC) und LPS, M (IC + LPS), die die Fähigkeit haben, die entzündliche Reaktion2,3deaktivieren. M (IC + LPS) unterscheiden sich von M(IL-4) Wundheilung Makrophagen und nicht ausdrücken, das Enzym Arginase (Arg-1) oder FIZZ14. Der beste Marker für diese entzündungshemmende Makrophagen ist ihre Zytokin-Produktion-5. Makrophagen haben mehrere Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit, aber auch zu entzündlichen Erkrankungen und Krebs3beitragen. Aus diesem Grund sind Makrophagen eine wichtige therapeutische Ziel für die Behandlung von einer Vielzahl von Krankheiten. Es ist wichtig zu untersuchen, die Auswirkungen von Antikörpern auf ihren Aktivierungsstatus zu Makrophagen-basierte Therapien für Krankheiten zu entwickeln.
Dieses Dokument konzentriert sich auf die Verwendung von murinen Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) und peritonealen Makrophagen, die Wirkung von Antikörpermedikamente auf Entzündungsreaktionen in Vitro und in Vivozu testen. Vor kurzem gab es mehrere Studien, die zeigen der Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung6,7,8. Gemeinsam mit Immun-komplexe, die Antikörper mit einem Antigen und LPS, normalerweise Entzündungsreiz komplexiert sind aktiviert Makrophagen produzieren sehr hohes Maß an den Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 und sehr niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukin 12 (IL-12)9. In Addition, Infliximab, ein monoklonaler Antikörper gegen TNF zur Arbeit, zum Teil durch Induktion entzündungshemmende Makrophagen durch seine Fragment kristallisierbares (Fc) Region7festgestellt wurde. Wir haben berichtet, dass IVIg + LPS entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung, die ähnlich M (IC + LPS) induzieren, wobei Co stimulierte Makrophagen produzieren große Mengen von IL-10 und geringe Mengen an die Untereinheit Pro-inflammatorische Zytokin Interleukin-12 oder 23 p40 ( Il-12/23p40), Interleukin-6 (IL-6) und TNF-8. IVIg ist ein Medikament, bestehend aus polyclonal Antikörper vor allem IgG, die aus dem Blut von mehr als 1.000 Spender10gebündelt hat. Es wird zur Behandlung einer Vielzahl von Immunkrankheiten wie idiopathische thrombozytopenische Purpura und chronische demyelinisierende Polyneuropathie, aber sein Wirkmechanismus ist nicht vollständig verstanden11. Die Auswirkungen der Antikörpermedikamente basierend auf Makrophagen Aktivierung können beurteilt werden, hierin beschriebene Methoden verwenden.
Die Auswirkungen von spezifischen Biologics auf Makrophagen Aktivierung können in BMDMs und peritonealen Makrophagen getestet werden. Mit Hilfe dieser Makrophagen Quellen ermöglicht Bewertung von Primärzellen. Vorläufige Tests von Antikörpern auf kultivierten Primärzellen erfordert weniger Zeit und finanzielle Investition als andere Zeit- und kostenintensiv Krankheitsmodelle. Durch Einspritzen eines Medikaments in einem gesunden Maus in Vivo, und die Zellen zu isolieren und ex Vivozu analysieren, kann man feststellen, ob Studien gerechtfertigt sind, um zu beurteilen, ob die Behandlung mit Biologics Makrophagen Aktivierung in Krankheitsmodellen betrifft.
Unsere Techniken bieten nur wenige Studien die Wirkung von biologischen Therapien auf Makrophagen Aktivierung in Vitro und in Vivo direkt testen einen Vorteil gegenüber alternativen Techniken. Aktuelle Techniken beinhalten Tests biologischen Drogenwirkungen auf gemischte Zelle Bevölkerungen in Vitro, wie z. B. die Wirkung von Infliximab in einem gemischten Lymphozyten Reaktion (MLR) oder IVIg auf menschliche Makrophagen in peripheren mononukleären Blutzellen, wo die Wirkung kann nicht auf eine bestimmte Zelle Typ7,12zurückführen. Mit BMDMs und peritonealen Makrophagen ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Zelllinien, wie RAW264.7 Zellen, die nicht die Pro-inflammatorische Zytokine produzieren, IL-12, als Reaktion auf LPS8,13. Testen die Wirkung von einem Antikörper-basierten Medikament auf Makrophagen Antworten ex Vivo hat Vorteile, weil direkt auf Makrophagen Cytokine Reaktionen zurückführen lassen, anstatt herleiten von Makrophagen Antworten durch die Messung der Serumspiegel Zytokin14 . BMDMs und peritonealen Makrophagen können abgeleitet und von genetisch veränderten Mäusen zu bestimmen, die spezifische Rolle eines Proteins in entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung isoliert. Wir haben z. B. Il10 mangelhaft(- / –) BMDMs zu zeigen, dass IVIg-induzierte Verringerung der Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen IL-108teilweise abhängig ist. Ein Medikament Wirkmechanismus untersucht werden kann verwenden westliche Beflecken, wo die Rolle der spezifischen Proteine und Signalisierung Ereignisse ermittelt werden kann. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) kann durchgeführt werden, auf BMDMs oder peritonealen Makrophagen Muster der Genexpression zu zeigen, die durch Antikörper Aktivierung entstehen. Krankheitsmodelle bei Mäusen bieten Informationen über die mögliche Wirksamkeit von Antikörper-basierten biologischen Therapien in Modellen für Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit, rheumatoide Arthritis und Krebs15,16, 17. jedoch die hier beschriebenen Techniken informieren über den Wirkmechanismus von diese Biologics durch die Bestimmung, ob sie entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität induzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Makrophagen Aktivierung Staaten spielen eine wichtige Rolle in beiden Gewebe Homöostase und Krankheit22. Makrophagen können unterschiedliche sowie überlappende Aktivierungsstatus abhängig von Cues in ihrer Mikroumgebung3haben. Sie haben unterschiedliche Rollen in allen Phasen der Entzündungsreaktion: Verteidigung gegen Krankheitserreger, Wunde heilen und Gewebe Restitution und haben auch eine ausgeprägte entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die wichtig für das Au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.k. ist der Empfänger von der University of British Columbia 4-Jahres-Stipendium (4YF) Diplom Zugehörigkeit Award. L.M.S ist der Empfänger der Canadian Association of Gastroenterology / Morbus Crohn und Colitis Kanada / CIHR neue Ermittler Gehalt Award und biomedizinische Stipendiat der Stiftung Michael Smith für die Gesundheitsforschung. Diese Arbeit wurde durch einen Projekt-Zuschuss von Canadian Blood Services in Zusammenarbeit mit der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (gewähren # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
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