Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux
Summary
Médicaments à base d’anticorps ont révolutionné le traitement de maladies inflammatoires. En plus d’avoir des effets directs sur des cibles spécifiques, les anticorps peuvent activent les macrophages pour devenir anti-inflammatoires. Ce protocole décrit comment anti-inflammatoires macrophage activation peut être évaluée in vitro, à l’aide des macrophages de la moelle osseuse de souris et in vivo, à l’aide des macrophages péritonéaux.
Abstract
Les macrophages sont phagocytaires cellules immunitaires innées, initier des réponses immunitaires aux agents pathogènes et de contribuer à la restitution de guérison et de tissus. Les macrophages sont tout aussi importants en éteignant les réponses inflammatoires. Nous avons montré que les macrophages stimulés par des immunoglobulines intraveineuses (IgIV) peuvent produire des quantités élevées de la cytokine anti-inflammatoire, interleukine 10 (IL-10) et de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires en réponse aux lipopolysaccharides bactériens) LPS). IVIg est qu’un anticorps polyvalent, principalement des immunoglobulines Gs (IgG), mis en commun par le plasma de plus de 1 000 donneurs de sang. Il est utilisé en complément des anticorps chez les patients atteints d’une déficience immunitaire ou pour supprimer les réponses immunitaires chez les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires. Infliximab, un anticorps thérapeutique anti-tumorale nécrose facteur alpha (TNFα) a aussi démontré qu’activent les macrophages pour produire l’IL-10 en réponse à des stimuli inflammatoires. IgIV et autres des produits biologiques à base d’anticorps peuvent être testés afin de déterminer leurs effets sur l’activation des macrophages. Cet article décrit des méthodes pour la dérivation, la stimulation et évaluation de la moelle épinière murine macrophages activés par l’anticorps in vitro et des macrophages péritonéaux murines activés avec anticorps in vivo. Enfin, nous montrent l’utilisation de western blot pour déterminer la contribution de cellule spécifique à l’activité des macrophages anti-inflammatoire des voies de signalisation. Ces protocoles peuvent être associés à des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer l’effet d’une ou des protéines spécifiques sur l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Ces techniques peuvent également servir à déterminer si les produits biologiques spécifiques peuvent agir en changeant les macrophages à un état d’activation anti-inflammatoires productrices de IL-10 qui réduit les réactions inflammatoires in vivo. Cela peut fournir des informations sur le rôle de l’activation de macrophages dans l’efficacité des produits biologiques au cours de modèles de maladies chez les souris et donnent un aperçu d’un nouveau mécanisme de potentiel d’action chez les personnes. À l’inverse, cela peut mettre en garde contre l’utilisationdes spécifiques produits biologiques à base d’anticorps pour traiter les maladies infectieuses, surtout si les macrophages jouent un rôle important dans la défense de l’hôte contre l’infection.
Introduction
Les macrophages sont des cellules immunitaires innées, qui jouent des rôles multiples dans la réponse immunitaire à l’infection ou de lésion. Les macrophages sont responsables d’initier une réponse immunitaire à l’infection ou un tissu de dommages, arrêt la réponse inflammatoire et favoriser la guérison de la réponse1. On peut citer les trois États d’activation mieux étudiés macrophage : 1) macrophages traités par l’interféron gamma (IFNγ) et bactérien lipopolysaccharide (LPS), désigné M (IFNγ + LPS), qui contribuent à la réponse inflammatoire ; 2) macrophages stimulés par l’interleukine 4 (IL-4), M(IL-4), qui sont associés à la réponse de guérison ; 3) macrophages stimulés par des complexes immuns (IC) et LPS, M (IC + LPS), qui ont la possibilité de désactiver la réponse inflammatoire2,3. M (IC + LPS) sont distinct des macrophages de cicatrisation M(IL-4) et n’expriment pas l’arginase enzyme (Arg-1) ou le FIZZ14. Le meilleur marqueur pour ces macrophages anti-inflammatoire est leur production de cytokine5. Macrophages ont plusieurs rôles dans le maintien de la santé, mais aussi contribuent à des maladies inflammatoires et cancer3. Pour cette raison, les macrophages sont une clé cible thérapeutique pour le traitement d’une grande variété de maladies. Il est important d’étudier les effets des anticorps sur leur état d’activation au point de traitements axés sur les macrophages pour maladie.
Le présent document porte sur l’utilisation des macrophages murins médullaire dérivé (BMDMs) et les macrophages péritonéaux pour tester l’effet des anticorps médicaments sur les réponses inflammatoires in vitro et in vivo. Récemment, il y a eu de nombreuses études montrant les effets d’anticorps le macrophage activation6,7,8. Macrophages activés conjointement avec des complexes immuns, qui sont des anticorps complexés avec un antigène et disques vinyles, un stimulus inflammatoire normalement, produisent des niveaux très élevés des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et des niveaux très faibles de la cytokine pro-inflammatoire, interleukine 12 (IL-12)9. En outre, infliximab, un anticorps monoclonal contre le TNFα, a été trouvé au travail, en partie, en induisant des macrophages anti-inflammatoires par le biais de son fragment cristallisable (Fc) région7. Nous avons rapporté qu’IgIV + LPS induisent l’activation de macrophage anti-inflammatoire qui est similaire à M (IC + LPS), dans laquelle macrophages stimulés co produisent de grandes quantités d’IL-10 et de faibles quantités de la sous-unité de la cytokine pro-inflammatoire interleukine 12 ou 23 p40 ( IL-12/23p40), l’interleukine-6 (IL-6) et TNF8. IVIg est un médicament composé d’anticorps polyclonaux, principalement l’IgG, qui a été mis en commun du sang de plus de 1 000 donateurs10. Il est utilisé pour traiter une grande variété de maladies immunologiques, telles que le purpura thrombopénique idiopathique et polyradiculonévrite démyélinisante, mais son mécanisme d’action n’est pas totalement comprise11. Les effets des médicaments de l’anticorps basé sur l’activation des macrophages peuvent être évaluées à l’aide des méthodes décrites dans les présentes.
Les effets des produits biologiques spécifiques sur l’activation des macrophages peuvent être testés dans les BMDMs et les macrophages péritonéaux. À l’aide de ces sources de macrophage permet d’évaluer des cellules primaires. Les essais préliminaires d’anticorps sur des cellules en culture primaire nécessite moins de temps et un investissement monétaire que les autres modèles de maladie longue et coûteuse. En injectant un médicament dans une saine de souris in vivoet les cellules d’isolement et en les analysant ex vivo, on peut déterminer si les études sont garantis afin de déterminer si le traitement avec des produits biologiques influe sur l’activation des macrophages dans les modèles de maladies.
Avec peu d’études tester l’effet des thérapies biologiques sur le macrophage activation in vitro et in vivo directement, nos techniques apportent un avantage sur les autres techniques. Les techniques actuelles comportent des effets de médicament biologique test sur cellules mixtes populations in vitro, tels que l’effet de l’infliximab dans une réaction lymphocytaire mixte (MLR) ou IVIg sur des macrophages humains en cellules mononucléaires de sang périphérique, où l’effet ne peuvent être attribués à une cellule spécifique type7,12. L’utilisation de BMDMs et macrophages péritonéaux est avantageux à l’aide de lignées cellulaires, telles que les cellules RAW264.7, qui ne produisent pas de la cytokine pro-inflammatoire, IL-12, en réponse à LPS8,13. Tester l’effet d’un médicament à base d’anticorps sur le macrophage réponses ex vivo a avantages parce que les cytokines peuvent être attribués directement à des macrophages, plutôt que de déduire les réponses de macrophages en mesurant les concentrations sériques de cytokines14 . BMDMs et macrophages péritonéaux peuvent être dérivés et isolés des souris génétiquement modifiées afin de déterminer le rôle spécifique d’une protéine dans l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Par exemple, nous avons utilisé Il10 déficients(- / –) BMDMs de démontrer qu’IgIV induite par la réduction de la production de cytokines pro-inflammatoires dépend partiellement de IL-10,8. Mécanisme d’un médicament d’action peut être étudiée à l’aide de western blot, où le rôle des protéines spécifiques et d’événements de signalisation peut être déterminé. PCR quantitative (qPCR) peut être effectuée sur les BMDMs ou les macrophages péritonéaux à montrent des profils d’expression génique qui résultent de l’activation de l’anticorps. Les modèles de maladies chez la souris peuvent fournir des informations sur l’efficacité potentielle des thérapies biologiques à base d’anticorps dans les modèles pour les maladies comme l’affection abdominale inflammatoire polyarthrite rhumatoïde, la maladie et le cancer15,16, 17. Toutefois, les techniques décrites ici vont renseignera sur le mécanisme d’action de ces produits biologiques en déterminant si elles induisent l’activité anti-inflammatoire macrophage.
Protocol
Representative Results
Discussion
États d’activation de macrophages jouent un rôle important dans les deux tissus l’homéostasie et maladie22. Les macrophages peuvent avoir distinctes ainsi que la superposition des États d’activation, selon repères dans leur microenvironnement3. Ils ont des rôles distincts dans toutes les étapes de la réponse inflammatoire : la défense contre les agents pathogènes, restitution de tissus et de guérison de blessure et ont aussi un état d’activation anti-in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.K. est le lauréat de l’Université de la Colombie-Britannique 4 ans (4YF) bourse d’études supérieures bourse. L.M.S. bénéficie d’une Association canadienne de gastro-entérologie / maladie de Crohn et la colite Canada / nouveau salaire de chercheur des IRSC Award et est un chercheur biomédical de la Michael Smith Foundation for Health Research. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet de la société canadienne du sang, en collaboration avec les instituts de recherche en santé (# CIHR2016-LS de subventions).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
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