تقييم آثار المخدرات على أساس الأجسام المضادة على موريني نخاع العظام وتنشيط بلعم البريتوني
Summary
المخدرات تستند إلى جسم قد أحدثت ثورة في علاج أمراض التهابات. بالإضافة إلى وجود تأثيرات مباشرة على أهداف محددة، يمكن تنشيط الأجسام المضادة الضامة لتصبح للالتهابات. هذا البروتوكول يصف بلعم الالتهابات كيف يمكن تفعيل المقررة في المختبر، باستخدام الماوس نخاع العظم الضامة، و الحية، استخدام الضامة البريتوني.
Abstract
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية متجولة، الشروع في الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض، ويسهم في رد الشفاء والأنسجة. الضامة نفس القدر من الأهمية في إيقاف تشغيل الاستجابات التحريضية. وقد أظهرنا أن الضامة حفزت مع الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg) يمكن أن تنتج كميات كبيرة من سيتوكين المضادة للالتهابات، انترلوكين 10 (إيل-10)، وانخفاض مستويات السيتوكينات الموالية التحريضية ردا على lipopolysaccharides البكتيرية ( لبس). IVIg هو جسم الشاملين، المقام الأول Gs (IgGs)، الغلوبولين المناعي المجمعة من البلازما من 1,000 أكثر من المتبرعين بالدم. يتم استخدامه لتكملة الأجسام المضادة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة أو لقمع الاستجابات المناعية في المرضى الذين يعانون من الشروط الذاتية أو تحريضية. كما تبين Infliximab، جسم ألفا (TNFα) عوامل علاجية المضادة لورم نخر، لتفعيل الضامة لإنتاج إيل-10 في الاستجابة للمحفزات التحريضية. ويمكن اختبار IVIg والبيولوجي الأخرى المستندة إلى جسم لتحديد آثارها على تفعيل بلعم. وتصف هذه الورقة أساليب الاشتقاق والتحفيز والتقييم مورين نخاع العظم الضامة تفعيلها من خلال الأجسام المضادة في المختبر والضامة البريتوني مورين المنشط مع الأجسام المضادة في الجسم الحي. وأخيراً، نحن شرح استخدام النشاف الغربية لتحديد مساهمة خلية معينة إشارات الطرق المؤدية إلى نشاط بلعم المضادة للالتهابات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات مع الفئران المعدلة وراثيا، لتحديد أثر protein(s) محددة على تفعيل بلعم المضادة للالتهابات. يمكن أيضا استخدام هذه التقنيات لتقييم ما إذا كان البيولوجي محددة قد تتصرف عن طريق تغيير الضامة إلى حالة تنشيط للالتهابات إيل-10-إنتاج يقلل من الاستجابات التحريضية فيفو. هذا تقديم معلومات عن دور التنشيط بلعم بفعالية من البيولوجي خلال نماذج المرض في الفئران، وتوفير نظرة ثاقبة إليه جديدة محتملة للعمل في الناس. على العكس من ذلك، هذا قد نحذر من استخدام البيولوجي القائم على جسم معين لعلاج الأمراض المعدية، ولا سيما إذا الضامة دوراً هاما في الدفاع المضيف ضد الإصابة بهذا.
Introduction
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية، التي تلعب أدواراً متعددة في الاستجابة المناعية للعدوى أو الإصابة. الضامة المسؤولة عن بدء استجابة مناعية لأضرار الإصابة أو الأنسجة ووقف الاستجابة الالتهابية، وتعزيز استجابة الشفاء1. من الدول التنشيط أفضل درس بلعم ثلاثة أمثلة: 1) الضامة تعامل مع الانترفيرون غاما (IFNγ) والبكتيرية lipopolysaccharide (LPS)، عينت M (IFNγ + لبس)، التي تساهم في الاستجابة الالتهابية؛ 2) الضامة حفزت مع انترلوكين 4 (إيل-4)، M(IL-4)، التي ترتبط برد الشفاء؛ 3) الضامة حفزت مع مجمعات محصنة (IC) ولبس، م (IC + لبس)، التي لها القدرة على إيقاف الاستجابة الالتهابية2،3. M (IC + لبس) مميزة من الجرح M(IL-4) شفاء الضامة، ولا تعبر عن إنزيم أرجيناسي (الأرجنتين-1) أو FIZZ14. هو علامة أفضل لهذه الضامة للالتهابات على إنتاج سيتوكين5. الضامة أدواراً متعددة في الحفاظ على الصحة، ولكن أيضا المساهمة في أمراض التهابات وسرطان3. وبسبب هذا، يتم الضامة هدفا علاجية رئيسية لمعالجة مجموعة متنوعة من الأمراض. من المهم أن التحقيق آثار الأجسام المضادة على دولته التنشيط لتطوير العلاجات المستندة إلى بلعم للمرض.
هذه الورقة ينصب على استخدام نخاع العظام مورين المستمدة الضامة (بمدمس) والضامة البريتوني لاختبار تأثير المخدرات جسم على الاستجابات الالتهابية في المختبر و في فيفو. في الآونة الأخيرة، كانت هناك عدة دراسات تبين آثار الأجسام المضادة في بلعم التنشيط6،،من78. الضامة تفعيلها يشترك مع مجمعات محصنة، وهي الأجسام المضادة الرصاصية مع مستضد، ولبس، حافزا عادة تحريضية، تنتج مستويات عالية جداً سيتوكين المضادة للالتهابات، وايل-10، ومستويات منخفضة جداً من سيتوكين برو التحريضية، انترلوكين 12 (إيل-12)9. وباﻹضافة إلى ذلك، infliximab، جسم [مونوكلونل] ضد TNFα، وقد تبين أن العمل، في جزء منه، عن طريق حفز الضامة للالتهابات عن طريق جزء للتبلر (Fc) المنطقة7. وقد أبلغنا أن IVIg + لبس الحث على تفعيل بلعم المضادة للالتهابات مشابه إلى M (IC + لبس)، حيث شارك حفز الضامة تنتج كميات كبيرة من إيل-10، وكميات قليلة من وحدة فرعية سيتوكين برو التحريضية انترلوكين 12 أو (23 p40 IL-12/23p40)، انترلوكين-6 (إيل-6)، وتنف8. هو IVIg مخدرات تتألف من [بولكلونل] أجسام، أساسا مفتش، وقد تم تجميعها من الدم من المانحين 1,000 أكثر من10. فهو يستخدم لعلاج طائفة واسعة من الأمراض المناعية، مثل برفرية الصفيحات مجهول السبب واعتلال دملينتينغ المزمن، ولكن إليه العمل ليست مفهومة تماما11. ويمكن تقييم آثار المخدرات جسم يقوم على تفعيل بلعم باستخدام الأساليب الموضحة هنا.
ويمكن اختبار آثار البيولوجيات محددة على تفعيل بلعم في بمدمس والضامة البريتوني. ويسمح استخدام هذه المصادر بلعم تقييم الخلايا الأولية. الاختبارات الأولية للأجسام المضادة على استزراع الخلايا الأولية يتطلب أقل وقت واستثمار النقد من نماذج أخرى المرض تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. عن طريق حقن مخدرات في ماوس صحية في الجسم الحي، وعزل الخلايا وتحليلها السابقين فيفو، واحد تحديد إذا كان هناك ما يبرر دراسات لتقييم ما إذا كان العلاج مع البيولوجي يؤثر على تنشيط بلعم في نماذج المرض.
مع قليل من الدراسات اختبار أثر العلاجات البيولوجية على بلعم التنشيط في المختبر و في فيفو مباشرة، توفير تقنيات لدينا ميزة على تقنيات بديلة. التقنيات الحالية تنطوي على آثار المخدرات بيولوجي التجارب على الخلايا المختلطة السكان في المختبر، مثل تأثير infliximab في رد فعل اللمفاويات مختلطة (شيخوا) أو IVIg في الضامة البشرية في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى، حيث الأثر لا يمكن أن يعزى إلى7،12نوع خلية محددة. استخدام بمدمس والضامة البريتوني مفيد عبر استخدام خطوط الخلايا، مثل خلايا RAW264.7، التي لا تنتج سيتوكين برو التحريضية، إيل-12، استجابة للبس8،13. اختبار تأثير المخدرات جسم على بلعم الردود السابقين فيفو ومزايا لأن الردود سيتوكين يمكن أن تعزى مباشرة إلى الضامة، بدلاً من استنتاج ردود بلعم بقياس مستويات المصل سيتوكين14 . يمكن مشتقة بمدمس والضامة البريتوني ومعزولة من الفئران المعدلة وراثيا لتحديد الدور المحدد للبروتين في تفعيل بلعم المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، قد استخدمنا Il10 نقص(-/-) بمدمس لإثبات تعتمد جزئيا على إيل-108المستحثة IVIg الحد من إنتاج سيتوكين برو التحريضية. إليه المخدرات من العمل يمكن أن يحقق استخدام النشاف الغربية، حيث يمكن تحديد دور بروتينات محددة وأحداث إشارات. يمكن تنفيذ الكمية البلمرة المتسلسل (قبكر) على بمدمس أو الضامة البريتوني لإظهار أنماط تعبير الجينات التي تنتج عن تنشيط الأجسام المضادة. نماذج المرض في الفئران يمكن أن تقدم معلومات عن فعالية العلاجات البيولوجية القائمة على جسم في النماذج المحتملة لأمراض مثل التهاب الأمعاء المرض والتهاب المفاصل والسرطان15،16، 17-بيد ستوفر التقنيات الموضحة هنا معلومات عن إليه عمل هذه البيولوجيات قبل تحديد سواء كانوا حمل بلعم مضادة للالتهابات النشاط.
Protocol
Representative Results
Discussion
بلعم التنشيط الدول دوراً هاما في كل الأنسجة التوازن والمرض22. يمكن أن يكون الضامة متميزة فضلا عن تداخل الولايات التنشيط، اعتماداً على الإشارات في بهم المكروية3. لديهم أدوار متميزة في جميع مراحل الاستجابة الالتهابية: الدفاع ضد العوامل الممرضة، والجرح برد الشفاء و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ل. ك. هو جائزة الدراسات العليا سنهم 4 سنوات الزمالة (4YF) جامعة كولومبيا البريطانية. L.M.S. هو المستفيد من “الرابطة الكندية” لأمراض الجهاز الهضمي/كرون والتهاب القولون كندا/جائزة استوفوا الجديد المحقق المرتب وهو أحد “علماء الطب الحيوي” “مؤسسة مايكل سميث” “الأبحاث الصحية”. بتأييد هذا العمل “منحة المشروع” من “خدمات الدم الكندية”، بالتعاون مع “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” (منح # CIHR2016-LS).
Materials
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins–understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
