精子的液化需要从精凝胶中解放出来。本研究提供了从雌性生殖道 post-coitus 中收集精子, 以及测定精子液化时间的程序。
在小鼠体内, 被射出的精子在子宫内沉积。射精后, 精子的一致性从凝胶状变为水样, 这一过程称为液化。在这项研究中, 我们展示了如何收集 post-ejaculated 精子从女性生殖道在一个小鼠模型。首先, 发情阶段的成年雌性老鼠在一夜之间被安置在一个雄性笼子里。第二天早上, 交配被证实的交配插头在阴道开口。交配插头的雌性小鼠被安乐死, 每个生殖道都被收集成一个整体 (阴道、子宫、输卵管、卵巢), 确保一个封闭的系统来控制精子。生殖道被放置在1.5 毫升离心管, 阴道被切断, 以释放的精子进入管。为了保证最大的精子量进行分析, 用无牙钳将子宫角从卵巢端挤压到阴道末端, 排出残余的精子。整个生殖道被丢弃。该精子管被短暂剥离。25μ l 毛细管吸管被放置在一个180°角 (平行于管壁) 管。记录了在25μ l 线上填充毛细管所用的时间。从一个成熟的雄性饲养者的精子通常需要大约60-180 秒来填满25μ l 毛细管。这种精子收集技术也可用于其他下游应用, 如精象和运动分析。
雌性生殖道由上部和下层组成。上生殖道包括输卵管、子宫和宫颈。下生殖道包括 ectocervix 和阴道。在人类, 被射出的精子沉积在阴道前壁, 毗邻 ectocervix1。然而, 在小鼠体内, 精子在交配2后几分钟内就会被扫入子宫。
精子含有精凝胶, 在射精的几秒钟内凝固, 导致精子被诱捕并固定在3。液化释放的固定精子通过改变精子从凝胶状到水样的一致性。这一过程对精子的运动和哺乳动物的繁殖至关重要。关于精子液化的知识主要是基于体外研究, 其中精子在培养皿中液化。在人类中, 前列腺特异抗原或 PSA (也称为激肽释放酶相关的肽3或 KLK3) 的酵素活性是通过水解 semenogelins (在精子中存在凝胶形成的蛋白质) 来液化的主要贡献者4 ,5,6。降解 semenogelins 释放精子从精物, 增加精子的流动性。自由精子游向输卵管, 使卵子受精。液化 (或精子粘度) 试验是标准的初步筛查精子分析的生殖诊所, 以评估男性生育能力7。
最近发表的一篇文章表明 , 从雌性小鼠生殖道 post – mating 中收集到的的分析可以用来说明液化的不足 , 从而导致生育缺陷8。有缺陷的液化, 如精子高, 导致 11.8-32.3% 的男性不育症患者的9, 表明正常的液化是必不可少的哺乳动物繁殖。然而, 对液化缺陷的研究和处理完全集中在男性7。女性生殖道在精子液化中发挥作用的可能性尚未得到探讨。因此, 收集和测定液化时间的方法将为研究人员提供一种新的诊断工具, 以确定液化是否可能是模型机体中不育的原因之一。
从小鼠子宫收集精子可以提供优于精子分析的优势体外, 因为前者可以说明精子与女性生殖道分泌物之间的生理相互作用.在这项研究中提出的技术使研究人员能够确定精子的质量, 以及在理想的生理条件下的活力和活力。此外, 还有各种各样的下游分析, 可以使用从子宫收集的精子, 例如, 精子可以计数, 以确定实际精子数进入子宫和精子也可以成像的运动化验。理想的时间点收集精子?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了兽医学院 (立) 启动基金对 WW 的支持。作者感谢塞拉奥尔森 (立) 对这篇手稿的批判性阅读。
Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
Waterbath | Precision | TSGP05 | |
Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |