חיסונית-פלורסנט תיוג של Microtubules וחלבונים Centrosomal Vivo לשעבר רקמת המעי ו 3D במבחנה Organoids מעיים
Summary
אנו מציגים פרוטוקולים עבור בידוד של מעיים 3D מבנים מרקמות ויוו ומוטבעים במבחנה המרתף מטריקס organoids, ואת קיבוע שונות פרט מכתים פרוטוקולים אופטימיזציה עבור תיוג חיסונית של microtubule, חלבונים centrosomal, מהחיבור באותה מידה כמו תא סמני כולל החלבון בתאי גזע Lgr5.
Abstract
כניסתו של organoids 3D במבחנה המחקים את ויוו רקמות ואדריכלות מורפוגנזה התקדמה באופן משמעותי את היכולת ללמוד שאלות מפתח ביולוגית התא וביולוגיה התפתחותית. בנוסף, organoids יחד עם ההתקדמות הטכנית המסירה הגן ויראלי ועריכה ג’ין מבטיח לקדם מחקר רפואי ופיתוח של תרופות חדשות לטיפול במחלות. Organoids גדלו במבחנה במטריצת המרתף לספק מערכות מודל חזק ללמוד את ההתנהגות והתפקוד של חלבונים שונים, גם מתאים עבור live-הדמיה של חלבונים מתויג פלורסנט. עם זאת, הקמת את הביטוי ואת לוקליזציה של החלבונים אנדוגני ברקמת לשעבר vivo ו- in vitro organoids חשוב לוודא את אופן הפעולה של החלבונים מתויגות. למטרה זו יש שפותחה ואנו ששינה רקמות בידוד, קיבוע, תיוג חיסונית פרוטוקולים עבור לוקליזציה של microtubules, חלבונים centrosomal, ומשויך ברקמת המעי vivo לשעבר , במבחנה organoids מעיים. המטרה הייתה מקבע לשמר את הארכיטקטורה תלת-ממד של הרקמה/organoids תוך שמירה על antigenicity נוגדנים והפיכה גם חדירה ואישור של מקבע, נוגדנים. חשיפה לקור depolymerizes והכל אבל microtubules יציבה וזה היה גורם מפתח בעת שינוי הפרוטוקולים השונים. מצאנו כי הגדלת ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) הריכוז של 3 מ מ עד 30 מ”מ נתן ניתוק יעיל villi, כוכים במעי הדק בזמן EDTA 3 מ מ היה מספיק עבור כוכים חוקן. פרוטוקול קיבוע פורמלדהיד מפותחת/מתנול נתן טוב מאוד לשימור מבניים תוך גם שמירה על antigenicity של תיוג יעיל של microtubules, אקטין את החלבונים (EB) סוף מחייב. זה גם עבדה ninein חלבון centrosomal למרות פרוטוקול מתנול עבד עקבי יותר. בהמשך הקמנו כי קיבוע, חיסונית-תיוג של microtubules וחלבונים הקשורים ניתן להשיג עם organoids מבודד או שנותרו בתוך המטריצה במרתף.
Introduction
היווצרות של epithelia עם קוטביות apico-הבסיס הוא תהליך מהותי בהתפתחות כולל ארגון מחדש דרמטי של microtubules, חלבונים centrosomal. מערך microtubule רדיאליים שמקורם microtubule centrosomal במיקום מרכזי ארגון מרכז (MTOC) בולטת בתאים בעלי חיים רבים וזה גם מתאים תאים שטוחה יחסית. לעומת זאת, תאי אפיתל טורי, כגון אלה של המעי, להרכיב הלא-רדיאלי transcellular microtubule מערכים תומכים יותר את הצורה ואת פונקציות מיוחדות של תאים אלה. הארגון מחדש דרמטי של microtubules מושגת על ידי centrosome לעבור איפקס ואת הפסגה MTOCs centrosomal (n-MTOCs) ויוצרים, אשר הופכת אחראית anchorage של transcellular microtubules1,2 , 3 , 4 , 5.
רוב הידע שלנו על בידול אפיתל וארגון microtubule המשויך הגיע מחקירות 2D במבחנה שכבות תאים שאינם מציגים את האדריכלות רקמות ויוו . פיתוח של תלת-ממד במבחנה תא צורב תרבויות, חלוץ ידי Clevers ועמיתים6, מייצג את ההתקדמות הטכנולוגית הגדולות כמו מחקים ויוו אדריכלות ופיתוח. היררכיה של בידול אפיתל מתבטא במעי; תאי גזע בחלק התחתון של כוכים להצמיח לא בוגר טרנזיט הגברה התאים להתרבות ובהבחנה בהדרגה ככל הם נודדים למעלה התת-קרקעי לתוך קטן סיסי מעיים או משטח חוקן, איפה הם הופכים באופן מלא הבדיל לפני לשפוך לתוך לומן7. חשוב, זה משוכפל במעיים organoids שבו להתרבות תאים גומחת תאי גזע ויוצרים ציסטות לאחר מכן לייצר קריפטה כמו ניצנים עם תאי גזע בחלק התחתון בידול מתקדם בהדרגה לעבר האזור ציסטה, אשר הופך את סיסי דמוי8. תא צורב במעיים ולכן מייצג במודל רב עוצמה כדי ללמוד לא רק microtubule וארגון centrosomal במהלך התמיינות אפיתל אבל רבים חלבונים אחרים, כמו גם מתן לפלטפורמה אידיאלית להקרנה של תרופות ומזון תרכובות של הפוטנציאל הטיפולי הטבות9,10.
Organoids מתאימים גם עבור live-הדמיה של חלבונים מתויג פלורסנט, שניהם טוק-, organoids הנוק-אאוט יכול להיווצר באמצעות שימוש CRISPR/Cas9 ג’ין עריכה11,12. עם זאת, הקמת את הביטוי ולוקליזציה של החלבונים אנדוגני שילמדו חשוב, במיוחד לאמת את אופן הפעולה של החלבונים מתויגות. תיוג חיסונית organoids 3D גדל מטריקס במרתף או לשעבר vivo מבודד רקמה מורכבת יותר תאים גדלו ב תרבות מנות ב- 2D. פרוטוקול קיבוע צריך לשמר את הארכיטקטורה 3D עדין של organoids תוך שימור עדיין נוגדן antigenicity (קרי, את epitopes עבור קישור נוגדנים). לדוגמה, 4% paraformaldehyde (PFA) משמש בדרך – כלל מקבע אך בזמן זה הוא מקבע המשחק מהירה יחסית ונותן טוב שימור מורפולוגי, מניסיוננו לעתים קרובות התוצאה היא אובדן של antigenicity אינה מתאימה עבור רבים נוגדנים centrosomal. יש גם לשקול את היכולת של מקבע, נוגדנים לחדור 3D מבנים ורקמה. למטרה זו, יש לשנות, פרוטוקולים שפותחו עבור בידוד הרקמות עקיף חיסונית-תיוג והצהרה של תלת-ממד במבחנה organoids, לשעבר vivo לבודד רקמת המעי. אנחנו מתארים כיצד לבודד כוכים קטנים במעיים ואת villi רקמת המעי הגס, כולל פרוטוקול עבור בידוד של organoids תלת-ממד כחלופה לתיקון ולקרוא חיסונית בתוך המטריצה במרתף. אנו מציגים שלושה פרוטוקולים קיבוע חלופי עבור חיסונית-תיוג של microtubules, חלבונים centrosomal, כגון ninein, וחלבונים microtubule מעקב סוף-פלוס (+ טיפים), כגון חלבונים EB ו קליפ-170 (ראה גם הפניות8, 13). נדון גם את היתרונות והחסרונות הקשורים לכל פרוטוקול.
Protocol
Representative Results
Discussion
בידוד של רקמת המעי
בידוד של כוכים קטנים במעיים, villi כוכים שטיפת המעי הגס כרוך חשיפת פני השטח הרירית, טיפול עם EDTA פתרון כדי לשחרר תא, fractionation (רועד) אנשי צנטריפוגה. פרוטוקול בידוד הציג מעיים villi/קריפטה שונתה. Belshaw et al. , וייטהד. et al. 17 , 18
חשיפת השטח הרירית
אנחנו ניסויים עם מספר גישות לחשוף את השטח הרירית של מערכת העיכול בפיתוח של הליך זה. בגישה הקלאסית היא אוורט (להפוך מבפנים החוצה) ברכבת התחתית, בדרך כלל בקטעים כ-100 מ מ ארוך, באמצעות מוט מתכת שנלכדו בקיפול של הרקמה על קצה אחד ואז רכבת הנותרים החליקה על צינור19. עבור העכבר רקמות, אידיאלי מוט מתכת (2.4 מ מ קוטר) עם קצוות מעוגלים. גישה זו יש את היתרון של הרחבת השטח הרירית המאפשר גישה טובה יותר PBS ו- EDTA. אנו בתחילה נעשה שימוש בגישה זו אך עבר ל חיתוך הצינור לתוך אורכים קצרים (כ 5 ס מ) ופתיחת כל מקטע עם נקרע מספריים. בזמן זה הוכיח יותר קל. גישה זו מתאימה רק אם המעיים כמה נדרשים; אבל אם בעלי החיים היו להיות בשימוש ניסוי ואז התקן בנוי למטרה עבור חיתוך פתח הצינור longitudinally, כפי שתואר על ידי. Yoneda et al. 14 יהיה יעיל יותר.
ניתוק villi, כוכים משכבת שרירים
בתחילה השתמשנו 3 מ מ EDTA ב- PBS ושעות ארוכות יחסית דגירה של עד 60 דקות לשחרר את השטח הרירית מ שבבסיס הרקמות17,18. בריכוז זה של EDTA מצאנו שזמן הדגירה של 30 דקות היה מספיק לשחרר כוכים מן המעי הגס העכבר. עם זאת, עבור הבידוד קריפטה/סיסי המעי הדק ניסינו באמצעות EDTA מרוכז יותר למשך זמן קצר יותר, שהוכחו גישה יעילה. כל העבודה שלאחר מכן נערך עם רקמת חילוץ באמצעות הטכניקה EDTA 30 מ מ, יצירת שברים הרלוונטיים villi או כוכים. עבור כוכים, נשקיע בדרך כלל שברים 3-5 לפני תיקון אך חשוב לבדוק אם הם שברים המתאים גם התזמונים יהיה תלוי במספר גורמים כגון מיקום לאורך צינור העיכול, הגיל של העכבר, דלקת, דיאטה הקודם , ועוד באופן דומה, משך הזמן הרקמה צריך להיות מזועזע בעקבות הטיפול EDTA יעיל עשוי להשתנות בתנאים שונים. התוצאה היא רקמה מבודדת שברים המכיל תערובת של villi כוכים או בעיקר villi או כוכים (איור 2). מאחר שאין שום villi במעי הגס, החילוץ קריפטה ייתכן השגה בצעד אחד ע י ניעור הרקמה בצינור ב-30 s. השברים האלה ואז ניתן לתקן ולעבד עבור תיוג חיסונית.
בידוד של המעי organoids חברת מטריקס במרתף
בידוד של organoids מן המרתף מטריקס כיפות יכולה להיות מושגת באמצעות פתרון שחזור התא. הפתרון עובד על-ידי depolymerizing המטריקס המרתף וג’ל אבל את הטמפרטורה שצריך 2-8 ° C. הערה של זהירות היא כי microtubules דינמי ייתכן לא יישמרו. לפיכך, עבור תיוג חיסונית של microtubules דינמי ו + טיפים כגון התא EBs, ההתאוששות מן המרתף מטריקס לפני קיבוע לא מומלץ. עם זאת, רוב microtubules בתאים תא צורב המבדילים יציבים יחסית, אלה נשתמרו (איור 6). זה גם פעלה היטב חיסונית-תיוג של חלבונים centrosomal, מהחיבור, כמו גם סמנים התא.
קיבוע פרוטוקולים
פורמלדהיד (טרי זני PFA) הוא cross-links מקבע יחסית מהירה אקטינג צורות הפיך ועובד 4% כדורגלן טוב לדוגמה, תיוג חיסונית microtubules, גמא-טובולין, צביעת חוטים אקטין עם Phalloidin. לדלל יותר מחברים פתרונות כגון % 1 פעלה היטב חיסונית-תיוג לדוגמה, עם תאי גזע סמנים Lgr5 ו- Paneth תא הסמן CD24 בתוך גומחת תאי גזע התת-קרקעי, בעוד ריכוז גבוה של מחברים לא פעלה.
התוספת של גלוטראלדהיד נותן יותר שימור microtubules את הקיבעון שנקרא PHEMO, אשר מורכב של תערובת של 3.7% מחברים, גלוטראלדהיד 0.05% ו- 0.5% אבקת PHEMO מאגר (צינורות 68 מ מ, 25 מ מ HEPES, 15 מ מ EGTA ו- 3 מ מ MgCl2)2 נותן מעולה לשימור microtubules מבלי להתפשר על antigenicity. זה עובד גם טוב עבור תיוג חיסונית גמא-טובולין, β-catenin, ו- E-קדהרין צביעת חוטים אקטין עם phalloidin. עם זאת, הרקמה 3D ובתרבויות תא צורב, הקיבעון PHEMO הפיק תוצאות לא עקביות, ולכן לא נעשה שימוש.
מתנול הוא מקבע קרישה נותן חדירה טובה יחסית, נוטה לשמר את antigenicity. קיבוע עם 100% מתנול (-20 ° C) מציג כמה הצטמקות, נותן שימור מורפולוגיה מתון, ועובד microtubules, + טיפים, נוגדנים centrosomal רבים כולל ninein תרביות תאים 2D. עם זאת, כמה organoids התמוטט כאשר משתמשים בשיטה זו קיבעון. בנוסף, חדירה של נוגדנים דרך כל כוכים, villi או organoids היה בתחילה בעיה אך התוספת של 0.1% סבון שטיפת פתרון, כביסה ממושך השיגו תוצאות טובות יותר.
שילוב של פורמלדהיד מתנול היה בשימוש בעבר על ידי רוג’רס. et al. 20 EB1 חיסונית תווית ב דרוזופילה. פרוטוקול קיבוע המבוססת על תערובת של פורמלדהיד, מתנול לכן פותחה עבור רקמת המעי ו- organoids מבוסס על 3% מתנול פורמלדהיד ו- 97% מקורר ל-20 ° C, אך משמיט את 5 מ מ סודיום קרבונט מעירוב ששימש רוג’רס ואח. 20 . בנוסף, דגימות היו קבועות במקפיא ב-20 ° C. זה עבד במיוחד בשביל חיסונית-תיוג + טיפים, כגון קליפ-170 ואת EBs, אבל גם הוכיחו מעולה עבור תיקון ולקרוא על-ידי חיסונית microtubules ואני אקטין בתוך רקמת ו 3D organoids. ברור היה טוב מאוד לשימור מבנים, antigenicity השתמר מספר חלבונים cytoskeletal ומשויך, כמו גם חלבונים centrosomal גמא-טובולין ו ninein, למרות תיוג עבור ninein עבד עקבי יותר עם מתנול קיבוע.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה פול תומאס מיקרוסקופ ייעוץ וסיוע. עבודה זו מעורב כאן נתמכה על ידי BBSRC (מענק. לא. BB/J009040/1 M.M.M., T.W.).
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
| lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
| 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
| goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
| Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
| Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
| MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
| Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
| Sodium citrate | antigen retrieval | ||
| Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
| DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
| Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
| Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
| Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
| 1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
| Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
| Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
| Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
| Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
| Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
| Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
| Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
| Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
| Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
| Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
| Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |
References
- Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
- Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
- Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
- Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
- Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
- Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
- Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
- Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042 (2015).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170’s key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
- Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
- Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
- Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
