T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü
Summary
Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.
Abstract
T lenfositler TCR etkinleştirme aşağıdaki birkaç dakika içinde meydana gelen hızlı, polarize işaret içinde meşgul. Bu oluşumu immünolojik sinaps, T hücre aktivasyonu düzenleyen ve directionally efektör yanıt hedefleyen bir sterotiplenmiş hücre-hücre kavşak neden olmaktadır. Bu süreçlerin etkin bir şekilde çalışmak için hızlı, polarize yanıt-e doğru esir alma için uyarlanmış bir düşsel yaklaşımı gereklidir. Bu iletişim kuralı ultraviyole ışığa maruz kadar yani uyarıcı olmayan bir photoactivatable peptid-Binbaşı MHC kompleksi (pMHC) dayalı böyle bir sistem açıklar. Hedeflenen Bu reaktif videomicroscopy deneyler sırasında decaging TCR etkinleştirme kesin kronolojik zamanmekansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü Imaging sonraki hücresel yanıtları toplam iç yansıma (TIRF) tarafından izleme sağlar. Bu yaklaşım da genetik ve farmakolojik pertürbasyon stratejileri ile uyumludur. Bu TCR sinyal immünolojik synapse altında yatan polarize hücre iskeleti yapıların oluşumu için bağlantı iyi tanımlanmış moleküler yolları Meclisi sağlar.
Introduction
T lenfositler (T hücreleri) hücresel bağışıklık hücre yüzeyine MHC bağlamında görüntülenen antijenik peptidler tanıyarak merkezi bir rol oynamaktadır. TCR tarafından aracılık ettiği, Antijen tanıma saf T hücre farklılaşma sürücüler ve cytolytic ve iletişimsel tepkileri efektör nüfus tarafından teslim teşvik etmektedir. TCR nişan da hücresel mimarisi dramatik değişiklikler neden olmaktadır. Birkaç dakika içinde T hücreleri taktımı immünolojik synapse (IS)1,2olarak bilinen bir polarize arayüz şekillendirme (APC), antijen sunan hücrenin kenarını üzerine. Is yönlü yayın sitokinler veya sitotoksik T lenfositler (CTL), APC yok litik proteinler durumunda etkinleştirerek T hücre efektör yanıt-e doğru potentiates.
TCR nişan pMHC tarafından bağlayıcı sonuçta sağlam sinaptik sitoiskeleti2/ remodeling teşvik T harekete geçirmek için hücreleri (LAT), dahil olmak üzere birden çok akış aşağı adaptör moleküllerin hızlı fosforilasyon neden olmaktadır. Kortikal ipliksi aktin (F-aktin) T hücre APC yüzeye yayılan sürücüler ve IS çevre ve tükenmesi Merkezi’nden F-aktin birikimi ile karakterize bir annüler yapıda giderir. F-aktin halka oluşumu sıkı hale gelmesini Mikrotubul organizasyon Merkezi (MTOC, T hücreleri centrosome olarak da bilinir) için hemen altında arayüzü merkezi bir konuma eşleşen. Her iki olay ilk Antijen tanıma dakika içinde oluşur ve hangi sonraki etkinleştirme olayları ve efektör yanıt ortaya mimari içerik oluşturun.
Is oluşumu çalışmaya, çeşitli labs APC immobilize TCR ligandlar içerir veya kendi ligandlar3,4içerir bir lipid bilayer destekler bir cam yüzey tarafından değiştirilir yaklaşımlar geliştirdi. T hücreleri tarafından toplam iç yansıma Floresans mikroskobu (TIRF) ya da yüksek çözünürlüklü çalışmalar erken T hücre aktivasyonu ve IS oluşumu etkinleştirme confocal mikroskobu görüntüsü bu yüzeylerde IS benzeri kişiler oluşturur.
Bu yaklaşımlar tam olarak birleştirilmiş IS mükemmel görselleştirme için izin vermiş olsa da, sinyal aşağıdaki TCR:pMHC ligasyonu çoğunu TCR harekete geçirmek doğru bir şekilde takip olayların sırasını belirlemek için çabalarını zorlaştıran saniye içinde oluşur . Bu sorunu aşmak için bir photoactivation yaklaşım, photoactivatable pMHC TCR harekete geçirmek5,6,7kronolojik zamanmekansal kontrolünü elde etmek için kullanılan geliştirilmiştir. Bu sistemde, T hücreleri içeren ultraviyole (UV) ışık ile ışınlanmış kadar TCR için uyarıcı sigara photoactivatable pMHC cam yüzeyler eklenir. T hücre yüzeyin mikron büyüklüğünde bölgenin UV ışınlama T hücre tarafından kabul edilebilir bir uyarıcı bölgesi oluşturmak photocage kaldırır. Sonraki sinyal olaylar ve hücre iskeleti remodeling sonra genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanarak izlenir. Antijenik peptidler, sınıf II MHC-Ek ve sınıf bağlamında ben MHC H2-Kb, anılan sıraya göre sunulur, güve sitokrom c88-103 (mm) ve ovalbumin257-264 (OVA), iki photoactivatable sürümü olmuştur (şekil 1) geliştirdi. Bu her iki CD4 analizini sağlar+ T hücreleri belirli mm-ben-Ek (5 C. ifade etmek için C7, 2B4, ya da ve TCRs) ve CD8+ T hücreleri belirli OVA-H2-Kb (OT1 TCR ifade).
Son on yıl içinde TCR photoactivation ve düşsel yaklaşımı erken TCR adımları sinyal kesin Kinetik kurmak ve polarize hücre iskeleti remodeling5, yöneten moleküler yolları tanımlamak için kullanılmıştır 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Örneğin, tahlil bu centrosome belirlemede etkili oldu APC doğru hale gelmesini lipid ikinci haberci diacylglycerol IS at merkezli yerelleştirilmiş bir degrade tarafından aracılık. Bu metodoloji yüksek çözünürlüklü görüntü analizi T hücre işlevinin talep uygulamaları için değerli olmaya devam edecektir tahmin edilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son yıllarda, ışık spatiotemporally kontrollü harekete geçirmek-in hücresel süreçler için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, her ilişkili avantajları ve dezavantajları. İmmobilize, hücre dışı ligandlar decaging üzerinde dayanır, burada açıklanan sistem hızlı, hücre altı, polarize sinyal yanıt analiz için idealdir. Bu yaklaşım yukarıda açıklandığı gibi T hücrelerinin oluşumunda IS incelemek için uygulanmıştır. Ayrıca, diğer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz üye Huse laboratuarının tavsiye ve yardım için teşekkür ederim. ABD Ulusal Sağlık (M.H. için R01-AI087644) ve P30-CA008748 Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi için Enstitüleri tarafından desteklenen.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
