Control espacial y Temporal de la activación de células T con un agonista de la Photoactivatable
Summary
Este protocolo describe un método basado en la proyección de imagen para activar los linfocitos T con photoactivatable péptido-MHC, que precisa control espacio-temporal de la activación de células T.
Abstract
Los linfocitos T participan en la señalización rápida, polarizado, que ocurre dentro de minutos después de la activación del TCR. Esto induce la formación de la sinapsis inmunológica, una ensambladura del estereotipado de la célula que regula la activación de la célula de T y direccionalmente apunta las respuestas efectoras. Para estudiar con eficacia estos procesos, es necesario un enfoque imagen adaptado para capturar respuestas rápidas, polarizadas. Este protocolo describe un sistema, que se basa en un photoactivatable péptido mayor complejo de histocompatibilidad (pMHC) que es no estimulante hasta que se expone a la luz ultravioleta. Decaging objetivo de este reactivo durante experimentos de videomicroscopía permite exacto control espacio-temporal de la activación del TCR y vigilancia alta resolución de posteriores respuestas celulares por reflexión interna total (TIRF) proyección de imagen. Este enfoque también es compatible con estrategias de perturbación genética y farmacológica. Esto permite el montaje de vías moleculares bien definidas que vinculan la señalización del TCR a la formación de las estructuras citoesqueléticas polarizadas que subyacen en la sinapsis inmunológica.
Introduction
Los linfocitos T (células T) juegan un papel central en la inmunidad celular mediante el reconocimiento de péptidos antigénicos en el contexto de la superficie de la célula MHC. Reconocimiento del antígeno, que es mediada por el TCR, conduce a la diferenciación de células ingenuas T y promueve la entrega de respuestas citolíticas y comunicativas por poblaciones efectoras. Participación de TCR también induce cambios dramáticos en la arquitectura celular. Dentro de minutos, las células T gloms sobre el lado de la célula presentadora de antígeno (APC), formando una interfaz polarizada conocida como sinapsis inmunológica (es) de1,2. LA potencia respuestas de células T efectoras habilitando la direccional liberación de citoquinas o, en el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruyen el APC.
Participación de TCR por pMHC induce la fosforilación rápida de múltiples moléculas de adaptador aguas abajo, incluyendo a Linker para las activación de las células T (LAT), que en última instancia promueve fuerte remodelación del citoesqueleto sináptico2. Cortical actinia filamentosa (F-actina) unidades de la célula de T que se separa sobre la superficie de la APC y entonces se resuelve en una estructura anular, caracterizada por la acumulación de la F-actina en la periferia es y agotamiento del centro. Formación del anillo de F-actina se acopla firmemente a la reorientación del centro organizador de microtúbulos (MTOC, también llamado centrosoma en las células de T) a una posición justo debajo del centro de la interfaz. Ambos eventos ocurren dentro de minutos del reconocimiento del antígeno inicial y establecen el contexto arquitectónico en que eventos posteriores de activación y efectora se producen las respuestas.
Para estudiar es formación, varios laboratorios han desarrollado enfoques que la APC se sustituirá por una superficie de vidrio que contiene ligandos inmovilizados de TCR o apoya una bicapa lipídica que sí mismo contiene los ligandos3,4. Las células T forman contactos es-como en estas superficies que pueden ser reflejadas por el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o microscopía confocal, lo que permite estudios de alta resolución de activación temprana de la célula de T y es la formación.
Aunque estos enfoques han permitido la visualización excelente del totalmente montado, gran parte de la ligadura de TCR:pMHC siguiente señalización ocurre dentro de segundos, que complica los esfuerzos para determinar la secuencia de eventos después de la activación del TCR con precisión . Para evitar este problema, se ha desarrollado un enfoque de fotoactivación, que pMHC photoactivatable se utiliza para lograr un control spatiotemporal de TCR activación5,6,7. En este sistema, las células T se unen a las superficies de vidrio que contienen pMHC photoactivatable que es no estimulantes para el TCR hasta irradiados con luz ultravioleta (UV). La radiación UV de una región de micras de tamaño de la superficie debajo de la célula T quita la photocage crear una zona estimulante que puede ser reconocida por la célula de T. Posteriores eventos de señalización y remodelación citoesqueleto entonces son monitoreados utilizando reporteros fluorescentes genéticamente codificados. Dos versiones de photoactivatable de péptidos antigénicos, polilla citocromo c88-103 (MCC) y ovoalbúmina257-264 (OVA), que se presentan en el contexto de la clase II MHC-Ek y la clase I MHC H2-Kb, respectivamente, han sido desarrollados (figura 1). Esto permite el análisis de ambos CD4+ T las células específicas para MCC-Ek (expresando lo 5 C. C7, 2B4, o y TCR) y CD8+ T las células específicas para OVA-H2-Kb (expresan el TCR de OT1).
En la última década, el enfoque de fotoactivación y proyección de imagen de TCR se ha utilizado para establecer la cinética precisa de TCR primeros pasos de señalización y también para identificar las vías moleculares que regulan la remodelación citoesqueleto polarizados5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por ejemplo, el ensayo era instrumental en la determinación de que el centrosoma reorientación hacia la APC está mediado por un gradiente localizado de lo lípidos segundo mensajero diacilglicerol centrada en el es. Se prevé que esta metodología seguirá siendo valioso para aplicaciones que exigen análisis proyección de imagen de alta resolución de la función de la célula de T.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los últimos años, la luz ha surgido como una excelente herramienta para la activación spatiotemporally controlada de procesos celulares. Diversas metodologías se han desarrollado, cada uno con desventajas y ventajas asociadas. El sistema descrito aquí, que se basa en la decaging de ligandos inmovilizados, extracelulares, es ideal para el análisis de las respuestas de señalización rápidas, subcelulares, polarizados. Este enfoque se ha aplicado para examinar la formación es en las células T como se describió…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Huse para asesoramiento y asistencia. El apoyo de los Estados Unidos institutos nacionales de salud (R01-AI087644 a M.H.) y P30-CA008748 al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
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