Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable
Summary
Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.
Abstract
Linfócitos T envolver-se na rápida, polarizado sinalização, ocorrendo dentro de minutos após a ativação do TCR. Isto induz a formação de sinapse imunológica, uma junção de célula-célula estereotipadas que regula a ativação de células T e metas direcionalmente respostas efetoras. Para estudar estes processos efetivamente, é necessária uma abordagem de imagem que é adaptada para a captura de respostas rápidas, polarizadas. Este protocolo descreve um sistema, que é baseado em um photoactivatable do peptide-major formando um complexo (pMHC) que é não-estimulatórios até que ele é exposto à luz ultravioleta. Decaging alvo estes reagentes durante experimentos de tele-microscopia permite controle spatiotemporal preciso da ativação do TCR e monitoramento de alta resolução de respostas celulares subsequentes por reflexão interna total (TIRF) de imagem. Essa abordagem também é compatível com estratégias de perturbação genética e farmacológicas. Isso permite que o conjunto das vias moleculares bem definidos que link TCR sinalização para a formação das estruturas do citoesqueleto polarizadas que fundamentam a sinapse imunológica.
Introduction
Linfócitos T (células T) desempenham um papel central na imunidade celular, reconhecendo peptídeos antigênicos exibidos no contexto da superfície de células MHC. Reconhecimento do antígeno, que é mediado pelo TCR, dirige a diferenciação de células T de ingênuo e promove a entrega de respostas citolíticas e comunicativas por populações efetoras. Noivado de TCR também induz mudanças dramáticas na arquitetura celular. Em poucos minutos, as células T cisma no lado da célula apresentadora de antígeno (APC), formando uma interface polarizada conhecida como sinapse imunológica (IS)1,2. A IS potencializa respostas de células T efetoras, permitindo o lançamento direcional de citocinas ou, no caso dos linfócitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruir o APC.
Noivado de TCR por pMHC induz a rápida fosforilação de várias moléculas de adaptador a jusante, incluindo o vinculador para as células de ativação de T (LAT), que, finalmente, promove a remodelação robusto do citoesqueleto sináptica2. Actina filamentosa cortical (F-Actina) conduz a célula T, espalhando sobre a superfície da APC e então resolve em uma estrutura anular caracterizada pelo acúmulo de F-Actina na periferia IS e depleção do centro. Formação de anel F-Actina é rigidamente acoplada a reorientação do centro organizador de microtúbulos (MTOC, também chamado a centrossoma em células T) para uma posição abaixo do centro da interface. Ambos os eventos ocorrem em poucos minutos de reconhecimento inicial do antígeno e estabelecer o contexto arquitetônico em que eventos de ativação subsequente e efetoras respostas ocorrem.
Para estudar a formação de IS, vários laboratórios desenvolveram abordagens em que o APC é substituído por uma superfície de vidro que contém ligantes TCR imobilizados ou suporta uma bicapa lipídica que em si contém o ligantes3,4. Células T formam IS-como contatos nestas superfícies que pode ser fotografada por microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia confocal, permitindo estudos de alta resolução do início da ativação de células T e formação de IS.
Embora essas abordagens têm permitido para excelente visualização do IS totalmente montado, grande parte da sinalização da seguinte ligadura TCR:pMHC ocorre em segundos, complicando os esforços para determinar a sequência de eventos após a ativação de TCR com precisão . Para contornar esse problema, uma abordagem de fotoativação foi desenvolvida, em que photoactivatable pMHC é usado para obter um controlo spatiotemporal de TCR ativação5,6,7. Neste sistema, as células T estão conectadas em superfícies de vidro contendo photoactivatable pMHC que é não-estimulatório de TCR até irradiadas com luz ultravioleta (UV). Irradiação UV de uma região de mícron de tamanho da superfície abaixo da célula T remove o photocage criando uma zona estimulatório que pode ser reconhecida pela célula T. Sinalização de eventos subsequentes e remodelação do citoesqueleto são então monitorados usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados. Duas versões de photoactivatable de peptídeos antigênicos, traça citocromo c88-103 (MCC) e no257-264 ovalbumina (OVA), que são apresentados no contexto da classe II MHC-eu… Ek e classe de MHC H2-Kb, respectivamente, foram desenvolvido (Figura 1). Isto permite a análise de ambos CD4+ T células específicas para MCC-l-Ok (expressando o 5 C. C7, 2B4, ou e TCRs) e CD8+ T células específicas para óvulos-H2-Kb (expressando o TCR OT1).
Na última década, a abordagem de fotoativação e imagem latente de TCR tem sido utilizada para estabelecer a cinética precisa de TCR primeiros passos de sinalização e também para identificar as vias moleculares que regem a remodelação do citoesqueleto polarizada5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. por exemplo, o ensaio foi fundamental na determinação que centrossoma reorientação em direção a APC é mediada por um gradiente localizado do lipídios segundo mensageiro diacilglicerol centrado no IS. Prevê-se que esta metodologia continuará a ser valioso para aplicações que exigem análise de imagens de alta resolução da função da célula T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos últimos anos, a luz tem emergido como uma excelente ferramenta para activação spatiotemporally controlada dos processos celulares. Várias metodologias têm sido desenvolvidos, cada um com as desvantagens e vantagens associadas. O sistema descrito aqui, que se baseia o decaging de ligantes extracelulares, imobilizados, é ideal para a análise das respostas de sinalização rápidas, subcellular, polarizadas. Esta abordagem tem sido aplicada para examinar a formação é em células T conforme descrito acima. Adic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do laboratório Huse para aconselhamento e assistência. Suportados pelos institutos nacionais de saúde (R01-AI087644 para MH) e P30-CA008748 ao Memorial Sloan-Kettering Cancer Center dos Estados Unidos.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
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