السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل
Summary
ويصف هذا البروتوكول أسلوب المستندة إلى تصوير لتنشيط الخلايا اللمفية تي MHC الببتيد فوتواكتيفاتابل، مما يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية لتنشيط الخلية T باستخدام.
Abstract
اللمفاويات T الانخراط في إشارات سريعة، والاستقطاب، التي تحدث في غضون دقائق بعد التنشيط تكر. وهذا يدفع تشكيل المشبك المناعية، مفترق الطرق نمطية خلية-خلية ينظم تنشيط خلية تي وتوجه يستهدف استجابات المستجيب. دراسة هذه العمليات فعالة، نهج تصوير مصمم خصيصا لالتقاط استجابات سريعة والاستقطاب اللازمة. ويصف هذا البروتوكول مثل هذا نظام، الذي يستند فوتواكتيفاتابل ببتيد-رئيسية histocompatibility معقدة (الرهن العقاري) التي غير محفزة حتى أنه يتعرض للأشعة فوق البنفسجية. ديكاجينج المستهدفة من هذا الكاشف أثناء تجارب فيديوميكروسكوبي يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية للتنشيط تكر ورصد الاستجابات الخلوية اللاحقة بالتأمل الداخلي الإجمالي (TIRF) التصوير عالية الدقة. وهذا النهج أيضا متوافقة مع استراتيجيات اضطراب الوراثية والدوائية. وهذا يسمح للجمعية العامة من المعالم المسارات الجزيئية التي تربط تكر يشير إلى تشكيل هياكل cytoskeletal الاستقطاب التي تكمن وراء المشبك المناعية.
Introduction
تي اللمفاويات (الخلايا T) تلعب دوراً مركزياً في مناعة خلوية بالاعتراف بمولده الببتيدات المعروضة في سياق سطح الخلية MHC. مستضد الاعتراف، الذي هو توسط تكر، محركات التفريق بين السذاجة تي الخلايا ويعزز تقديم استجابات السكان المستجيب عن والتواصل. مشاركة تكر يستحث أيضا تغييرات جذرية في البنية الخلوية. في غضون دقائق، جلومس الخلايا T إلى الجانب من الخلية عرض مستضد (APC)، تشكل واجهة استقطاب المعروفة باسم المشبك المناعية (ق. أ)1،2. هو يقوي التي تعالج ردود الخلية T المستجيب بتمكين الإفراج عن الاتجاه السيتوكينات، أو في حالة اللمفاويات T السامة للخلايا (CTLs)، البروتينات الحال التي تدمر APC.
مشاركة تكر بالرهن العقاري يدفع الفسفرة السريع متعددة الجزيئات محول المتلقين للمعلومات، بما في ذلك رابط “تنشيط تي” الخلايا (LAT)، الذي يعزز في نهاية المطاف إعادة عرض قوي cytoskeleton متشابك2. أكتين الخيطية القشرية (F-أكتين) محركات الأقراص خلية T تنتشر فوق سطح آسيا والمحيط الهادئ، وثم يحل في بنية حلقية تتميز بتراكم واكتين في محيط هو واستنفاد من المركز. أحكام يقترن تشكيل عصابة واكتين لإعادة توجيه مركز تنظيم microtubule (بعد، كما دعا سينتروسومي في خلايا تي) إلى موضع تحت مركز الواجهة فقط. كل الأحداث تحدث في غضون دقائق اعتراف مستضد الأولية وإنشاء السياق المعماري المستجيب وأحداث التنشيط اللاحقة التي تحدث استجابات.
دراسة تشكيل هو، طورت مختبرات مختلف النهج الذي يتم استبداله في آسيا والمحيط الهادئ على سطح زجاج الذي يحتوي على يغاندس تكر المعطل تداولها أو يدعم دهن بلير نفسه يحتوي على3،يغاندس4. وتشكل الخلايا T هو مثل جهات الاتصال على هذه الأسطح التي يمكن تصويرها بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence المجهر (TIRF) أو [كنفوكل] مجهرية، تمكين الدراسات ذات الدقة العالية من أوائل تي خلية التنشيط وهو تشكيل.
على الرغم من أن هذه النهج قد سمحت لرؤية ممتازة من هو مجمع بشكل كامل، تحدث الكثير من ربط TCR:pMHC إرسال الإشارات التالية في غضون ثوان، إلى تعقيد الجهود الرامية إلى تحديد تسلسل الأحداث بعد التنشيط تكر بدقة . للالتفاف حول هذه المسألة، وضعت نهجاً فوتواكتيفيشن، التي يستخدم فيها فوتواكتيفاتابل الرهن العقاري لتحقيق الرقابة الزمانية المكانية تكر التنشيط5،،من67. في هذا النظام، يتم إرفاق الخلايا T بالواجهات الزجاجية التي تحتوي على الرهن العقاري فوتواكتيفاتابل التي غير محفزة تكر حتى المشع مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية). يزيل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية لمنطقة ميكرون الحجم من السطح أسفل الخلية T فوتوكاجي إنشاء منطقة تنشيطية يمكن التعرف عليه بواسطة الخلية T. ثم يتم رصد الأحداث إرسال الإشارات اللاحقة وإعادة عرض cytoskeletal الصحفيين الفلورسنت وراثيا المشفرة باستخدام. فوتواكتيفاتابل إصدارين من الببتيدات المستضديه، العثة السيتوكروم ج88-103 (MCC) و ovalbumin257-264 (OVA)، التي ترد في سياق الطبقة MHC ثانيا-هك والفئة الأول MHC H2-كب، على التوالي، وقد تم البلدان المتقدمة النمو (الشكل 1). وهذا يتيح تحليل CD4 كلا+ تي الخلايا المحددة للتنسيق الإداري هك (التعبير عن جيم 5 C7، 2B4، أو تكرس) و CD8+ تي الخلايا المحددة للبويضات-H2 كب (الإعراب عن تكر OT1).
على مدى العقد الماضي، قد استخدم نهج فوتواكتيفيشن وتصوير تكر إنشاء حركية دقيقة من أوائل تكر مما يشير إلى الخطوات وأيضا لتحديد المسارات الجزيئية تحكم الاستقطاب يعيد سيتوسكيليتال5، 6 , 7 , 8 , 9 , 10. على سبيل المثال، المقايسة كان مفيداً في تحديد تلك سينتروسومي إعادة توجيه نحو APC هو توسط تدرج مترجمة من diacylglycerol رسول الدهن الثانية تركزت في هو. ومن المتوقع أن تواصل هذه المنهجية أن تكون قيمة بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب تحليل التصوير عالي الدقة للدالة T الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي السنوات الأخيرة، برز الضوء كأداة ممتازة للتنشيط التي تسيطر عليها سباتيوتيمبورالي من العمليات الخلوية. قد وضعت منهجيات مختلفة، مع كل المزايا المرتبطة بها وعيوب. النظام المذكور هنا، الذي يستند إلى ديكاجينج يغاندس المعطل تداولها، خارج الخلية، مثاليا لتحليل استجابات إرسال الإشارات الس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء المختبر هوس لتقديم المشورة والمساعدة. تدعمها الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة (R01-AI087644 إلى M.H.) و P30-CA008748 إلى مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
