Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1
Summary
Este estudo estabelece um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena com reductase (RTX). Uma única dose de RTX (50 µ g/kg) é ideal para o desenvolvimento de um modelo de neuropatia de pequenas fibras que imita as características do pacientes e pode ajudar a investigar o significado molecular nociceptivo subjacente a dor neuropática.
Abstract
Pacientes com diabetes mellitus (DM) ou aqueles que experimentam os efeitos neurotóxicos dos agentes quimioterápicos podem desenvolver transtornos sensação devido à degeneração e lesão dos neurônios sensoriais de pequeno diâmetro, referida como neuropatia de pequenas fibras. Modelos animais presentes de neuropatia de pequenas fibras afetam ambas as fibras sensoriais de grande e pequena-diâmetro e assim criar uma neuropatologia demasiado complexo para avaliar correctamente os efeitos do lesionado fibras sensoriais de pequeno diâmetro. Portanto, é necessário desenvolver um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena adequadamente examinar estas questões. Este protocolo descreve um modelo experimental de neuropatia de pequenas fibras especificamente que afetam os nervos sensoriais de pequeno diâmetro com reductase (RTX), um agonista ultrapotente transitória do receptor potencial da tipo do vanilloid de 1 (TRPV1), através de uma dose única de injeção intraperitoneal, referida como neuropatia RTX. Esta neuropatia RTX mostrou manifestações patológicas e anormalidades comportamentais que imitam as características clínicas dos pacientes com neuropatia de pequenas fibras, incluindo intra-epidérmicas degeneração de fibras nervosas (IENF), especificamente de lesões em neurônios de pequeno diâmetro e indução térmico obtidos e alodinia mecânica. Este protocolo testado três doses de RTX (200, 50 e 10 µ g/kg, respectivamente) e concluiu que uma dose de crítica de RTX (50 µ g/kg) é necessária para o desenvolvimento das manifestações de neuropatia de fibra pequena típica e preparado um procedimento modificado imunocoloração para investiga IENF degeneração e lesão neuronal soma. O procedimento modificado é rápida, sistemática e econômica. Avaliação comportamental de dor neuropática é essencial para revelar a função dos nervos sensoriais de pequeno diâmetro. A avaliação dos limiares de mecânicas em roedores experimentais é particularmente desafiadora e este protocolo descreve uma malha de metal personalizada que é apropriada para este tipo de avaliação em roedores. Em resumo, neuropatia RTX é um modelo experimental de novo e facilmente estabelecido para avaliar a significância molecular e intervenção subjacentes dor neuropática para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.
Introduction
Neuropatia de pequenas fibras envolvendo dor neuropática, que é evidente pela degeneração do IENFs, é comum em vários tipos de condições, tais como DM e como resultado os efeitos neurotóxicos da agentes quimioterapêuticos1,2, 3,4,5. IENFs são os terminais periféricos dos neurônios de pequeno diâmetro, localizados no gânglio da raiz dorsal (DRG) e são afetados em paralelo em caso de degeneração de IENF6. Por exemplo, a transcrição genética montante alterada do somata neuronal demonstrou o upregulation de ativação de transcrição fator-3 (ATF3)6,7. Além disso, a avaliação da inervação IENFs com biópsia de pele é útil para o diagnóstico de neuropatia de pequenas fibras5,8,9. Tradicionalmente, os perfis das IENFs sobre a biópsia de pele têm dependia de imuno-histoquímica demonstração do produto do gene da proteína 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Tomados em conjunto, os perfis patológicos de DRG e IENFs refletem a neuropatia de pequenas fibras subjacente condição funcional e podem ser um indicador para as consequências funcionais deste tipo de neuropatia em neurônios de pequeno diâmetro.
Anteriormente, vários modelos experimentais têm abordou a questão da degeneração IENF em casos de neuropatia induzida por quimioterapia12,13 e nervo lesões causadas por compressão ou transecção de14,15 , 16. estes modelos experimentais também afetou os nervos de grande diâmetro; foi, portanto, não é possível excluir a contribuição dos nervos de grande diâmetro afetados em neuropatia a fibra pequena observados; por exemplo, o exame de desordem de thermosensation pela retirada nociva depende funcional fibras nervosas motoras17,18,19. Assim, estabelecer um modelo de neuropatia de pura fibra pequena e sistematicamente a investigar o estado patológico do somata neuronal e suas fibras de nervo periféricas cutâneas nos neurônios de pequeno diâmetro são necessário e imperativo.
RTX é um análogo da capsaicina e um potente agonista ao receptor transitória potencial vanilloid receptor 1 (TRPV1), que medeia o processamento nociceptivo20,21,22. Recentemente, tratamento de RTX periférico aliviou a dor neurogênica23,24,25 e uma injeção intraganglionic de RTX induzida perda irreversível da DRG neurônios22. O efeito da administração de RTX periférica é dose-dependente20,26,27, que resultou na dessensibilização transitória ou degeneração de IENFs. Curiosamente, tratamento de RTX sistemático do elevado-dose levou a dor neuropática28, um sintoma da neuropatia de pequenas fibras. Estes achados sugerem que o modo de tratamento e dose de RTX produzam efeitos patológicos distintos e respostas neuronais; a saber, administração periférica impediu a transmissão de dor por efeitos locais29 e afetou o somata neuronal que desenvolveu comportamento neuropática6. Coletivamente, esses achados indicam que RTX tem um efeito multipotency e levantou a questão de saber se existe uma dose específica de RTX que sistematicamente poderia afetar os nervos periféricos, tais como o IENFs periféricas e central somata neuronal. Em caso afirmativo, RTX poderia ser um potencial agente especificamente afetar os neurônios de pequeno diâmetro e imitar a neuropatia de pequenas fibras na clínica. Por exemplo, o DM na clínica é uma questão complicada, incluindo distúrbio metabólico e neuropatologia de nervos periféricos, que são as principais características da neuropatia de pequenas fibras. Os mecanismos de neuropatia associada a DM pequena fibra não poderiam excluir a contribuição da desordem metabólica que pode não ser o principal agente que afectam os nervos periféricos. Portanto, a neuropatia associada a DM pequena fibra requer um modelo animal puro que pudesse excluir os efeitos da desordem metabólica sistemática. Este protocolo descreve a dose de trabalho de RTX para desenvolver um modelo de neuropatia de fibra pequena típica, incluindo IENF degeneração e lesão do neurônio de pequeno diâmetro, como demonstrado pela análise de imunocoloração modificados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapia eficaz de neuropatia de pequenas fibras na clínica é necessária para promover a recuperação funcional e qualidade de vida dos pacientes. Atualmente, não há falta de um guia terapêutico visando a desordem sensorial associada com a neuropatia de pequenas fibras devido à falta de compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes a lesão neuronal de pequeno diâmetro. Modelos anteriores de neuropatia geralmente afetado ambos os nervos sensoriais de grande e pequena-diâmetro; por exemplo, os mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência e tecnologia (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) e objetivo para a concessão de universidades de topo (TP105PR15), universidade médica de Kaohsiung, Taiwan.
Materials
| Chemical reagent | |||
| Resiniferatoxin | Sigma | R8756 | |
| Tween 80 | Sigma | P1754 | |
| 3,3’-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| avidin-biotin complex | Vector | PK-6100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antisera | |||
| Peripherin | Chemicon | MAB-1527 | |
| ATF3 | Santa Cruz | SC-188 | |
| PGP9.5 | UltraClone | RA95101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antisera | |||
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector | BA-1000 | |
| Texas Red-conjugated goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-075-146 | |
| Isothiocyanate (FITC)-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-095-152 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hot plate | IITC | Model 39 | |
| von Frey filament | Somedic Sales AB | 10-600-0001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Shandon coverplate | Thermo scientific | 72110017 | |
| Slide rack | Thermo scientific | 73310017 |
References
- Shun, C. T., et al. Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments. Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).
- Polydefkis, M., et al. The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy. Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).
- Holland, N. R., et al. Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases. Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).
- Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies. Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).
- Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution. Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy. Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).
- Fukuoka, T., et al. Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation. Pain. 153 (1), 68-79 (2012).
- Joint Task Force of the, E., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).
- Hsieh, S. T. Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy. Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy. Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).
- Kennedy, W. R. Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs. Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).
- Verdu, E., et al. Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice. Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).
- Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy. Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).
- Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. Pathology of nerve terminal degeneration in the skin. J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).
- Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury. Brain Res. 1589, 15-25 (2014).
- Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).
- Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury. Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).
- Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).
- Hsieh, Y. L., et al. Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy. PLoS One. 7 (11), e50805 (2012).
- Neubert, J. K., et al. Peripherally induced resiniferatoxin analgesia. Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).
- Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Apostolidis, A., et al. Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin. Urology. 65 (2), 400-405 (2005).
- Helyes, Z., et al. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund’s adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).
- Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity. Anesth Analg. 94 (5), 1253-1258 (2002).
- Helyes, Z., et al. Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat. Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).
- Kissin, I. Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity. Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).
- Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).
- Iadarola, M. J., Mannes, A. J. The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control. Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).
- Zimmermann, M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16 (2), 109-110 (1983).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Cliffer, K. D., et al. Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat. Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).
- Lipton, R. B., et al. Taxol produces a predominantly sensory neuropathy. Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy. Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).
- Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion. Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).
- Caudle, R. M., et al. Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells. Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).
- Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).
- Athanasiou, A., et al. Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death. Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).
- Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy. Mol Pain. 12, (2016).
- Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy. Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).
- Chao, C. C., et al. Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials. Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).
- Kim, S. H., Chung, J. M. An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain. 50 (3), 355-363 (1992).
