Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador
Summary
Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.
Abstract
Los astrocitos son las células principales en el cerebro y contacta directamente con las sinapsis y los vasos sanguíneos. Aunque las células microgliales se han considerado las principales células inmunes y solamente fagocitos en el cerebro, estudios recientes han demostrado que los astrocitos también participan en diversos procesos fagocíticos, tales como eliminación de sinapsis desarrollo y despacho de placas de beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer (AD). A pesar de estos resultados, la eficiencia de la inmersión de astrositos y degradación de sus objetivos es confusos en comparación con la de microglia. Esta falta de información se debe principalmente a la falta de un sistema de ensayo en el que la cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglía son fácilmente comparables. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un a largo plazo vivir-proyección de imagen en vitro ensayo fagocitosis para evaluar la capacidad fagocitaria de purificada astrocitos y microglía. En este ensayo, detección en tiempo real de la inmersión y la degradación es posible usando sinaptosomas conjugado con indicador de pH, que emiten fluorescencia roja brillante en orgánulos ácidos, tales como lisosomas. Nuestro ensayo novela proporciona una detección simple y eficaz de la fagocitosis a través de imágenes en vivo. Además, este ensayo de fagocitosis en vitro puede utilizarse como una plataforma de proyección para identificar productos químicos y compuestos que pueden potenciar o inhibir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Como mal funcionamiento de la poda sináptica y acumulación de la proteína patógena han demostrado como causantes de trastornos mentales y enfermedades neurodegenerativas, productos químicos y compuestos que modulan la capacidad fagocitaria de las células gliales deberán ser útiles en el tratamiento de varios trastornos neurológicos.
Introduction
Células gliales, que se refieren a las células no excitables en el cerebro, son el tipo de células principales en el sistema nervioso central (SNC). Anteriormente, las células glial fueron miradas como meras células de soporte que principalmente desempeñan un papel pasivo en el mantenimiento de propiedades sinápticas basals y la supervivencia neuronal. Sin embargo, nuevas pruebas ha revelado que las células gliales desempeñan un papel más activo en diversos aspectos de la neurobiología, como mantenimiento de la homeostasis cerebral, mediar la sinapsis formación1,2,3 y sinapsis eliminación4,5y modulando la plasticidad sináptica6,7. Las células gliales en el SNC son los astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Entre estas células, los astrocitos y microglia han demostrado que desempeñan funciones fagocíticas por englobamiento sinapsis4,5, de células apoptotic8, desechos neuronales9y proteínas patógenas, tales como beta amiloide placas10,11. En el cerebro en desarrollo, los astrocitos eliminan sinapsis en el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) a través de fagocitosis dependiente del MERTK y MEGF104. Del mismo modo, microglia también eliminan sinapsis C1q cubierto durante etapas de desarrollo a través de la cascada de complemento clásico5. Curiosamente, se ha sugerido que defectos en la poda de la sinapsis pueden ser uno de los iniciadores de varios desordenes neurológicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones en componente del complemento 4 (C4), que aumenta la poda de la sinapsis mediada por el complemento por microglía, son fuertemente asociadas con la prevalencia de la esquizofrenia en los seres humanos12. Un trabajo reciente también ha demostrado que la vía clásica del complemento es ligerament en las etapas de iniciación de AD e induce pérdida de sinapsis temprana de esta enfermedad13.
En comparación con la fagocitosis mediada por la microglía, si fagocitosis mediada por astrositos contribuye a la iniciación y progresión de varias enfermedades neurológicas es menos clara. Sin embargo, un artículo reciente sugiere que factores que alteran el ritmo de poda normal de la sinapsis por astrocitos pueden alterar la homeostasis cerebral y contribuyen a la patología y susceptibilidad de anuncio14. El tipo de poda de la sinapsis por astrocitos es poderosamente controlado por ApoE isómeros, con un alelo protector para AD (ApoE2) aumentar fuertemente la tasa y un alelo de riesgo para la EA (ApoE4) reducir significativamente la tasa de. Por otra parte, los ratones transgénicos que expresaban ApoE4 acumulan C1q sináptica mucho más que control o ApoE2 ratones14. Estos datos sugieren que deteriorada fagocitosis mediada por astrositos en principios cerebro AD puede inducir la acumulación de desechos senescentes revestido de C1q sinapsis/synaptic que activa fagocitosis complemento-mediada microglial, conducción sináptica degeneración . La capacidad fagocítica deteriorada de astrocitos en portadores ApoE4 puede también contribuir a la acumulación incontrolada de las placas de beta amiloide en los cerebros afectados por el anuncio.
Además, se ha demostrado que células gliales en el cerebro de Drosophila de perder su capacidad fagocítica por disminución traducción de Draper, un homólogo de Megf10 que los astrocitos phagocytosing la sinapsis. Restauración de niveles de Draper rescató la capacidad fagocitaria de las células gliales, que eficientemente dañado escombros axonal en el cerebro envejecido a un grado similar que en el cerebro joven, indicando que envejecimiento inducido por alteraciones en la capacidad fagocitaria de astrocytes pueden contribuir a la interrupción de la homeostasis cerebral15.
Partiendo de estos nuevos hallazgos, modulando la capacidad fagocitaria de astrocytes puede ser una estrategia terapéutica atractiva para prevenir y tratar diversos trastornos neurológicos. En este sentido, ha habido varios intentos para mejorar la capacidad fagocitaria de los astrocitos, por ejemplo, induciendo la acidificación de los lisosomas con nanopartículas ácidos16 y overexpressing el factor de transcripción EB (TFEB), que puede mejorar de la biogénesis del lisosoma17. A pesar de estos intentos, no está todavía claro cómo los astrocitos y las células microgliales se diferencian en su cinética fagocítico y si nosotros debemos aumentar o disminuir su capacidad fagocítica en diversas enfermedades.
En este trabajo presentamos un ensayo de novela en vitro para la detección de la capacidad fagocitaria de los astrocitos en tiempo real. Los datos muestran diferentes cinéticas de inmersión y degradación en astrocitos y microglía. Medio condicionado por astrositos (ACM), que contiene factores secretados de astrocitos, es esencial para la fagocitosis eficaz de astrocitos y microglia. Además, Megf10, un receptor fagocítico en astrocitos y un homólogo de Ced-1 y Draper, juega un papel crítico en la fagocitosis mediada por astrositos8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo se presentan métodos para un largo plazo imágenes viven en vitro fagocitosis ensayo usando células gliales purificadas y sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Se muestra que en comparación con la microglia, astrocitos poseen diferente capacidad de inmersión y degradación durante la fagocitosis de sinaptosomas. Además, nuestros datos sugieren que factores secretados de astrositos, que contienen moléculas puente como GAS6, proteínas y MEGE8, son esenciales para la fagocitosis depen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Jung Yeon-Joo por su apoyo experimental durante la purificación de synaptosome y Jungjoo Corea Parque imágenes de sinaptosomas con exposición de PS. Además, agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Chung de discusión útil. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de investigación de concesión de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 y NRF-2016R1C1B3006969) (W. S. C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
