PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון
Summary
פרוטוקול זה מציג במבחנה הדמיה לחיות phagocytosis assay כדי למדוד את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. עכברוש מטוהרים האסטרוציטים מיקרוגלייה משמשים יחד עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. שיטה זו ניתן לזהות בזמן אמת קינטיקה היבלעות והשפלה ומספקת פלטפורמה הקרנה מתאימים כדי לזהות גורמים להתכוונן אסטרוציט phagocytosis.
Abstract
האסטרוציטים סוג התא העיקריים במוח, צור קשר ישירות הסינפסות וכלי הדם. אמנם היה נחשב microglial תאים תאים חיסוניים העיקריים של phagocytes רק במוח, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי האסטרוציטים ישתתפו גם תהליכים phagocytic שונים, כגון סינפסה התפתחותיות לביעור ואישור של פלאק עמילואיד ביתא מחלת אלצהיימר (AD). למרות ממצאים אלה, את היעילות של אסטרוציט היבלעות והשפלות של המטרות שלהם לא ברור של מיקרוגלייה. חוסר מידע הוא בעיקר בשל היעדר מערכת assay שבו קינטיקה של phagocytosis אסטרוציט ו מיקרוגלייה-בתיווך דומות בקלות. כדי להשיג מטרה זו, פיתחנו לטווח ארוך הדמיה לחיות במבחנה phagocytosis assay כדי להעריך את יכולת phagocytic של האסטרוציטים מטוהרים, מיקרוגלייה. זה assay, זיהוי בזמן אמת של היבלעות והשפלה הוא אפשרי באמצעות pH מצומדת מחוון synaptosomes, אשר פולטים פלואורסצנטי אדום בהיר ב organelles חומצי, כגון lysosomes. Assay הרומן שלנו מספקת זיהוי פשוטה ויעילה של phagocytosis באמצעות הדמיה לחיות. בנוסף, זה וזמינותו phagocytosis במבחנה יכול לשמש כפלטפורמה ההקרנה כדי לזהות חומרים כימיים ותרכובות שניתן לשפר או לעכב את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. כמו גיזום סינפטית תקלה והצטברות חלבונים פתוגניים הוכחו לגרום הפרעות נפשיות או מחלות ניווניות, כימיקלים, תרכובות לווסת את יכולת phagocytic של תאי גליה אמור לסייע בטיפול שונים הפרעות נוירולוגיות.
Introduction
גלייה, אשר מתייחסות הלא-טמפרמנט תאים במוח, הם סוג התא העיקריים במערכת העצבים המרכזית (CNS). בעבר, גלייה היו נחשבים תאים התומכים גרידא, בעיקר לשחק בתפקידים פסיביים בשמירה על הישרדות עצביים ומאפיינים סינפטית הבזליים. עם זאת, ראיות המתעוררים חשף כי גלייה ממלאים תפקידים פעילים יותר בהיבטים שונים של הנוירו-ביולוגיה, כגון שמירה על הומאוסטזיס המוח, מתווכים סינפסה היווצרות1,2,3 וסינפסה חיסול4,5, להתכוונן הפלסטיות הסינפטית6,7. גלייה ב מערכת העצבים כוללים האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. בין תאים אלה, האסטרוציטים מיקרוגלייה הוכחו ממלאים תפקידים phagocytic על ידי שתבלע הסינפסות4,5, מוות תאים8, פסולת עצבית9ו חלבונים פתוגניים, כגון בטא עמילואיד שלטי10,11. במוח המתפתח, האסטרוציטים לחסל סינפסות הגבי גרעין הברך הצדי (dLGN) עד MERTK ותלוי MEGF10 phagocytosis4. באופן דומה, מיקרוגלייה גם לחסל את הסינפסות מצופים C1q בשלבים התפתחותיים דרך המפל המשלים הקלאסית5. מעניין, הוצע כי פגמים סינפסה גיזום ניתן לאחד היזמים של מספר הפרעות נוירולוגיות. לדוגמה, הוכח כי מוטציות בגן רכיב המשלים 4 (C4), מה שמעלה גיזום סינפסה בתיווך המשלים על-ידי מיקרוגלייה, משויכים מאוד השכיחות של סכיזופרניה בני12. עיתון האחרונות הראו גם כי מסלול המשלים הקלאסית hyperactivated בשלבים חניכה של AD, גורם לאבדן מוקדם סינפסה זו מחלה13.
לעומת phagocytosis בתיווך מיקרוגלייה, אם phagocytosis בתיווך אסטרוציט תורמת החניכה, התקדמות של הפרעות נוירולוגיות שונות הוא פחות ברור. עם זאת, עיתון האחרונות עולה כי גורמים לשנות את הקצב של גיזום סינפסה נורמלי על ידי האסטרוציטים עלול לשבש את המוח הומאוסטזיס, לתרום הרגישות, פתולוגיה לספירה14. הקצב של גיזום סינפסה על ידי האסטרוציטים בעוצמה נשלטת על ידי ספקיות isomers, עם אלל מגן עבור המודעה (ApoE2) בחריפות שיפור הקצב ואת הסיכון אלל עבור המודעה (ApoE4) באופן משמעותי להורדת הקצב. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים ביטוי ApoE4 שהצטברו C1q סינפטית הרבה יותר מאשר השליטה או עכברים ApoE2 14. נתונים אלו מראים כי ליקויי phagocytosis בתיווך אסטרוציט בתחילת המודעה המוח עלול לגרום ההצטברות של פסולת senescent מצופים C1q הסינפסות/סינפטית שמפעיל phagocytosis microglial בתיווך המשלים, נהיגה ניוון סינפטית . הקיבולת phagocytic לקוי של האסטרוציטים ב ApoE4 נושאות עשוי גם לתרום הצטברות הפלאק בטא עמילואיד במוח מושפע לספירה לא מבוקרת.
בנוסף, הוכח כי תאי גליה במוח דרוזופילה בגילאי לאבד את יכולת phagocytic בשל ירידה תרגום של דרייפר, homolog של Megf10 האסטרוציטים להשתמש עבור phagocytosing הסינפסות. שחזור דרייפר רמות הציל את יכולת phagocytic של תאי גליה, אשר מסומנת ביעילות פסולת עצב פגומים במוח בגילאי במידה דומה עד כדי כך במוח הצעיר, המציין כי הזדקנות-induced שינויים בקיבולת phagocytic האסטרוציטים עשוי לתרום להפרעה של המוח הומאוסטזיס15.
בהתבסס על הממצאים החדשים, להתכוונן מקיבולת האסטרוציטים phagocytic עשוי להיות אסטרטגיית טיפולית אטרקטיבי כדי למנוע ולטפל בהפרעות נוירולוגיות שונות. בהקשר זה, היו מספר ניסיונות לשפר את יכולת phagocytic של האסטרוציטים, לדוגמה, על-ידי גרימת לחומצי lysosomes עם חלקיקים חומצי16 , overexpressing גורם שעתוק EB (TFEB), אשר ניתן לשפר ליזוזום להן17. למרות נסיונות אלו, זה עדיין לא ברור איך האסטרוציטים ותאים microglial נבדלים קינטיקה phagocytic שלהם, אם אנחנו צריכים להגדיל או להקטין את קיבולות phagocytic שלהם למחלות שונות.
בנייר זה, אנו מציגים וזמינותו של הרומן במבחנה לגילוי מקיבולת האסטרוציטים phagocytic בזמן אמת. הנתונים מראים שונים קינטיקה של היבלעות והשפלה האסטרוציטים ו מיקרוגלייה. בינוני אסטרוציט ממוזגים (ACM), אשר מכיל גורמים המופרש מן האסטרוציטים, חיוני phagocytosis יעיל של האסטרוציטים והן מיקרוגלייה. יתר על כן, Megf10, קולטן phagocytic האסטרוציטים, על homolog של סיד-1 , דרייפר, ממלא תפקידים חיוניים phagocytosis בתיווך אסטרוציט8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, נציג שיטות לטווח ארוך הדמיה לחיות במבחנה phagocytosis assay באמצעות גלייה מטוהרים synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. אנחנו מראים כי בהשוואה מיקרוגלייה, האסטרוציטים בעלי קיבולת היבלעות והשפלה שונים במהלך phagocytosis של synaptosomes. בנוסף, הנתונים שלנו מראים כי מופרש אסטרוציט גורמים, אשר מכילים מולקולות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים יונג יון-ג’ו לתמיכה ניסיוני שלה במהלך טיהור synaptosome ופארק Jungjoo על תמונות של synaptosomes עם חשיפה PS. בנוסף, אנו מודים לכל החברים במעבדה של צ’ונג לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2016M3C7A1905391 ו- NRF-2016R1C1B3006969) (וו-S. ג).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
