الرقم الهيدروجيني رواية حية في المختبر -تصوير بوساطة "الإنزيم Astrocyte البلعمه استخدام" مؤشر مترافق سينابتوسوميس
Summary
ويقدم هذا البروتوكول في المختبر تصوير لايف البلعمه مقايسة لقياس قدرة astrocytes متجولة. وتستخدم الفئران المنقي astrocytes و microglia جنبا إلى جنب مع سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن حركية الإحاطة وتدهور في الوقت الحقيقي ويوفر منصة فحص مناسبة لتحديد العوامل تحوير astrocyte البلعمه.
Abstract
أستروسيتيس النوع من الخلايا الرئيسية في المخ والاتصال مباشرة بنقاط الاشتباك العصبي والأوعية الدموية. على الرغم من أن خلايا microglial اعتبرت الخلايا المناعية الرئيسية والبالعات فقط في الدماغ، قد أظهرت الدراسات الحديثة أن أستروسيتيس أيضا المشاركة في مختلف العمليات متجولة، مثل القضاء على المشبك التنموية وتطهير لويحات بيتا اميلويد في مرض الزهايمر (AD). وعلى الرغم من هذه النتائج، كفاءة الإحاطة astrocyte وتدهور من أهدافها غير واضحة مقارنة مع ميكروجليا. وهذا الافتقار إلى المعلومات الغالب بسبب الافتقار إلى نظام مقايسة فيه حركية البلعمه astrocyte و microglia وساطة قابلة للمقارنة بسهولة. ولتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير الطويلة الأجل العيش-التصوير في المختبر البلعمه مقايسة لتقييم قدرة متجولة المنقي astrocytes و microglia. في هذا التحليل، كشف في الوقت الحقيقي للإحاطة وتدهور من الممكن استخدام سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني، التي تنبعث منها ومضان أحمر مشرق في العضيات الحمضية، مثل ليسوسوميس. لدينا المقايسة رواية يوفر الكشف عن بسيطة وفعالة البلعمه من خلال تصوير العيش. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الإنزيم البلعمه في المختبر كمنصة فحص لتحديد المواد الكيميائية والمركبات التي يمكن أن تعزز أو تعوق قدرة astrocytes متجولة. كما عطل التقليم متشابك وتراكم البروتينات المسببة للمرض قد ثبت أن يسبب اضطرابات عقلية أو أمراض الأعصاب، المواد الكيميائية والمركبات التي تعدل متجولة قدرة الخلايا الدبقية ينبغي أن يكون مفيداً في معالجة مختلف الاضطرابات العصبية.
Introduction
الخلايا الدبقية، والتي تشير إلى الخلايا غير منفعل في الدماغ، هي نوع الخلية الرئيسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). سابقا، كانت تعتبر الخلايا الدبقية مجرد الخلايا الداعمة التي أساسا تلعب دوراً سلبيا في الحفاظ على بقاء الخلايا العصبية وخصائص متشابك القاعدية. ومع ذلك، تظهر الأدلة كشفت أن الخلايا الدبقية تلعب دوراً أكثر نشاطا في مختلف جوانب علم الأعصاب، مثل الحفاظ على التوازن في الدماغ، بوساطة المشبك تشكيل1،،من23 والمشبك القضاء على4،5و6،اللدونة متشابك تحوير7. وتشمل الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي أستروسيتيس، وميكروجليا، وأوليجوديندروسيتيس. بين هذه الخلايا وأستروسيتيس و microglia قد ثبت أن تلعب أدواراً متجولة التي تجتاح الاشتباكات العصبية4،5، أبوبتوتيك خلايا8والحطام العصبية9والبروتينات المسببة للمرض، مثل بيتا اميلويد لويحات10،11. في الدماغ، إزالة astrocytes الاشتباكات العصبية في نواة يتناول الظهرية الجانبية (دلجن) عن طريق البلعمه تعتمد على ميرتك و MEGF104. وبالمثل، microglia أيضا القضاء على الاشتباكات العصبية المغلفة C1q خلال مراحل النمو من خلال تتالي تكملة الكلاسيكية5. من المثير للاهتمام، أشير إلى أن العيوب في تشذيب المشبك يمكن أن تكون أحد المبادرين بالعديد من الاضطرابات العصبية. على سبيل المثال، فقد ثبت أن الطفرات في تكملة العنصر 4 (C4)، مما يزيد من تشذيب المشبك مكملاً بوساطة من microglia، مرتبطة بقوة مع انتشار مرض الفصام في البشر12. ورقة صدرت مؤخرا قد بينت أيضا أن مسار تكملة الكلاسيكية هايبراكتيفاتيد في مراحل بدء الإعلان والحث على الفقدان المبكر المشبك في هذا المرض13.
وبالمقارنة مع وساطة microglia البلعمه، ما إذا كانت تساهم بوساطة astrocyte البلعمه بدء وتطور مختلف الاضطرابات العصبية أقل وضوحاً. بيد أن ورقة صدرت مؤخرا تشير إلى أن العوامل التي تغير معدل التقليم المشبك العادي قبل astrocytes قد زعزعة التوازن الدماغ ويسهم إعلان قابلية وعلم الأمراض14. معدل التقليم المشبك ب astrocytes قوة يسيطر ايزومرات الذين ، مع اليل واقية للإعلان (ApoE2) بقوة تعزيز المعدل واليل خطر للإعلان (ApoE4) إلى حد كبير في تخفيض المعدل. وعلاوة على ذلك، تراكمت الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ApoE4 C1q متشابك أكثر بكثير من السيطرة أو الفئران ApoE2 14. تشير هذه البيانات إلى أن ضعف أستروسيتي بوساطة البلعمه في وقت مبكر قد يحفز الدماغ الإعلانية تراكم الحطام مسن المغلفة C1q الاشتباكات العصبية/متشابك التي ينشط فيها تكملة بوساطة microglial البلعمه، يقود تنكس متشابك . ضعف قدرة متجولة astrocytes في ناقلات ApoE4 قد يسهم أيضا في تراكم لويحات بيتا اميلويد في العقول المتأثرة بالإعلان غير المنضبط.
وبالإضافة إلى ذلك، قد تبين أن الخلايا الدبقية في الدماغ المورفولوجية العمر تفقد قدرتها متجولة بسبب انخفاض ترجمة دريبر، هومولوج من Megf10 التي تستخدم أستروسيتيس فاجوسيتوسينج نهايات. استعادة مستويات دريبر أنقذت متجولة قدرة الخلايا الدبقية، وكفاءة إزالة الحطام محواري التالفة في الدماغ عمره بدرجة مماثلة كالتي في الدماغ الشباب، مشيراً إلى أن الشيخوخة الناجمة عن التغييرات في قدرة متجولة أستروسيتيس قد تسهم في اختلال التوازن في الدماغ15.
وبناء على هذه النتائج الجديدة تحوير متجولة قدرة astrocytes قد تكون استراتيجية علاجية جذابة لمنع وعلاج مختلف الاضطرابات العصبية. وفي هذا الصدد، كانت هناك عدة محاولات لتعزيز قدرة متجولة من أستروسيتيس، على سبيل المثال، من خلال حفز تحمض lysosomes مع جسيمات نانوية الحمضية16 وأوفيريكسبريسينج عامل النسخ EB (تفيب)، التي يمكن أن تعزز نشوء حيوي يحلول17. وعلى الرغم من هذه المحاولات، أنها لا تزال غير واضحة كيف تختلف astrocytes وخلايا microglial في هذه الحركية متجولة وإذا نحن ينبغي زيادة أو إنقاص قدراتها متجولة في مختلف الأمراض.
في هذه الورقة، نقدم رواية في المختبر فحص للكشف عن قدرة astrocytes متجولة في الوقت الحقيقي. إظهار البيانات حركية مختلفة للإحاطة وتدهور في astrocytes و microglia. Astrocyte مكيفة المتوسطة (ACM)، الذي يحتوي على عوامل يفرز من أستروسيتيس، أمر ضروري البلعمه الفعالة لكل من أستروسيتيس وميكروجليا. وعلاوة على ذلك، Megf10، ومستقبل متجولة في أستروسيتيس وهومولوج صعقة-1 و دريبر، يلعب أدواراً حاسمة في البلعمه astrocyte بوساطة8،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نقدم طرق الطويلة الأجل العيش-التصوير في المختبر البلعمه مقايسة استخدام الخلايا الدبقية المنقي وسينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني. نظهر بالمقارنة مع microglia، أستروسيتيس تمتلك قدرة الإحاطة والتدهور المختلفة أثناء البلعمه سينابتوسوميس. وبالإضافة إلى ذلك، لدين…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون “جونغ” يون-جو لدعم تجريبية لها أثناء تنقية سينابتوسومي وحديقة جونججو لصور سينابتوسوميس مع التعرض PS. وباﻹضافة إلى ذلك، ونحن نشكر جميع الأعضاء في مختبر تشونغ لمناقشة مفيدة. هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (جبهة الخلاص الوطني) منحة ممولة من الحكومة الكورية (مسيب) (2016M3C7A1905391-جبهة الخلاص الوطني وجبهة الخلاص الوطني-2016R1C1B3006969) (دبليو-س. ج).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
