부활의 휴면 벼룩 마그나: 프로토콜 및 응용 프로그램

다음과 같은 SOP 제공 벼룩 마그나 부활 하는 데 사용 하는 프로토콜에 대 한 단계별 설명 휴면 계란, 샘플링, 침전 물, 그리고 클론 문화 ( 의 설립에서 ephippia의 격리에 대 한 자세한 설명을 포함 하 여 그림 1). 그림 1:의 부활에 대 한 단계별 가이드 벼룩 마그나. 자연 담 수 서식 지 (A)에서 퇴적 피스톤 corer (B)로 샘플링 된다. 퇴적 코어 (C)에서 증분 계층 1 또는 0.5 cm (D)의 슬라이스 이다. 토사의 각 레이어는 어둡고 차가운 조건 (4 ° C)에서 샘플 지퍼 잠금 가방 (E)에 저장 됩니다. 토사의 각 계층은 무게와 sieved 지질 체 (1 밀리미터 및 125 µ m 메쉬 크기, F)을 사용 하 여. 흰색 배경 트레이 벼룩 마그나 ephippia (G)를 분리 하는 데 사용 됩니다. Decapsulated 휴면 계란 (H)는 접시에 전송 하 고 부 화를 유도 하기 위해 빛과 온도 자극에 노출. 파묻혀는 항아리 (나) isoclonal 라인 구축 별도로 전송 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 1입니다. 퇴적 코어의 샘플링 호수 또는 연못 피스톤 corer를 사용 하 여 샘플 앙금. 이 프로토콜 사용 빅 벤27, 밧줄에 있는 막대는 침전 물에 튜브를 연결 corer 머리 피스톤 이루어져 코어 튜브 길이 약 1.5 m의 내부 튜브 직경의 14 cm. 빅 벤. 핵심 포 수 전체 코어 튜브의 지원 에이즈 침전 물. 퇴적 물을 돌출 하는 프레임 워크 직 립 및 고정, 코어 튜브를 유지 하 고 수정된 병 잭 압출 과정 (보충 비디오 1) 피스톤을 위쪽으로 밀어 하는 데 사용 됩니다. 미만 1m 깊이 얕은 연못, 수동으로 퇴적 물을 밀어 직경의 더 이상 6 cm의 플 렉 시 글라스 중력 corer 사용 하 여. 깊은 호수 (> 6 m 깊이의), 리빙스턴 피스톤 corers28 또는 단일 드라이브 그리피스 침전 물 corers를 사용 하 여 고정된 철 주 보트의 에이즈. 리빙 스톤-타입 드라이브 로드 피스톤 corer 통합된 호수 앙금의 부드러운 연속 1 미터 드라이브 수집에 깊은 약 30 m까지 물에 사용할 수 있습니다. 리빙 스톤 드라이브 막대에 표준 폴 리 카보 네이트 튜브를 연결 하는 간단 하지만 강력한 코어 머리 단일 드라이브 그리피스 corer에 의하여 이루어져 있다. corers 봉와 토사에 밀려는 고 피스톤 토사 (그림 2)의 복구에 필요한 흡입을 제공 한다. 지속적인 검색, 그대로 코어 vibracoring를 사용 합니다. 이러한 corers 물 깊이의 다양 한 작업과 앙금 lithology에 따라 서로 다른 길이의 코어 샘플을 검색할 수 있습니다. 연결 된 배럴 또는 코어 튜브를 통해 아래로 vibracore 머리에서 전송 되는 낮은 진폭 진동 liquefies 앙금, 액상된 퇴적 물에 침투 하는 vibracore 단위에 연결 된 코어 배럴을 사용. 어떤 vibracorers는 소형, 경량, 및 휴대용, 다른 대형 선박에서 배포할 수 있는 큰 무거운 단위. Corers의 앙금의 lithology에 따라 달라 집니다. 1 cm 이하의 편평한 금속 표면 (보조 비디오 1)를 사용 하 여 증분 층에서 코어를 가로로 슬라이스. 여기에 사용 되는 것 같은 침전 물 corers는 압출, 퇴적 층의 감소에 액체 정역학 압력을 줄이기 위해 설계 되었습니다. 다른 corers를 사용 하면 레이어 중 오염 제한에 블레이드의 쿠키 커터 종류 각 퇴적 층의 외부 껍질을 제거할 수 있습니다. 별도 샘플링 가방 (보충 비디오 1), 각 퇴적 층을 수집 하 고 어둡고 추운 (4 ° C) 조건 저장. 방사성 연대 측정에 대 한 모든 레이어에서 토사의 5 g의 최소를 수집 합니다. 방사능 연대 측정 데이트 분석 결과 대 한 자세한 설명을 위해 만든된 프로토콜입니다, 기존 게시12,13를 참조 하십시오. 그림 2: 절차를 유선 피스톤의 만화. 피스톤 corer, 내부 슬라이딩 도장 (피스톤) 약한 진공을 생성 하는 빈 관 피스톤 퇴적 물 인터페이스 건드리면, 무게는 침전 물에 코어 배럴을 민 다 고 진공 토사를 입력 하 여 퇴적 층을 방해 하지 않고 튜브 위로 이동 되 고 응어리를 빼내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 2. 앙금 층의 체질 전체 규모를 사용 하 여 나중에 참조할 각 퇴적 층 무게. 면적 및 무게를 사용 하 여 호수에서 종 밀도 계산 하. 다른 각각의 위에 쌓여의 지질 체 2 개를 사용 하 여 각 퇴적 층 체질. 첫 번째 체 1mm의 메쉬 크기는 그리고 찰 흙, 대형 무척 추 동물 및 미 립 자 물질, 예: 씨앗, 식물 및 곤충는 토사의 나머지에서 분리. 두 번째 체 125 µ m의 메쉬 있으며 디 만화 ephippia 및 작은 미 립 토사 (보충 비디오 2)의 나머지에서 분리. 흰색 배경 용지함에 125 µ m 메쉬 체에 수집 된 침전 물 분수의 작은 aliquots를 전송 합니다. 토사의 종류에 따라 각 번에 앙금의 작은 또는 큰 aliquots는 전송 수 있습니다. 작은 볼륨을 추가 (최대 200 mL) 샘플링 흰색 트레이 다시 옮겨진된 퇴적 물 분수를 일시 중단 하 고 눈 ephippia (그림 3)의 안보를 촉진 하는 매체의. Dechlorinated 수돗물, 시추공 물, 콤보29또는 아담 매체 (Aachener Daphnien)30매체는 앙금을 resuspend 하는 데 사용 될 수 있습니다. 여기서 부터는, 용어 ‘매체’ 중 하나 또는 모든 나열 된 솔루션을 참조 하도록 사용 됩니다. 그림 3: 벼룩 마그나 ephippium입니다. Decapsulation 직후 휴면 벼룩 마그나 계란. Ephippium (A), (B), 내부 계란 막과 휴면 계란 (C). 표시 됩니다. 눈금 막대 = 500 µ m. 3입니다. decapsulation Ephippia 및 해칭 일회용 파스퇴르 피 펫 또는 서 집게를 사용 하 여, 전송 개별 ephippia 접시에 담긴 매체의 10 mL 있습니다. 앙금의 층 당 적어도 페 트리 접시를 사용 합니다. 스테레오 현미경, decapsulate 각 ephippia를 사용 하 여 서 겸 오픈 여 틴 케이스 (보조 비디오 3). 계란, 중단 하지에 주의 기울이고 휴식 계란 내부 막 섬세 하 게, 제거 하 고 중간 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 가득 페 트리 접시에 그들을 전송. 그러나 Decapsulation D. 마그나; 부 화 성공, 그것은 필요 하지 않을 수 있습니다 늘리거나 다른 벼룩 종은 더 작은 ephippia를 생산에 대 한 도전 될 수 있습니다. 제어 온도 장치 (인큐베이터) 또는 방 전체 스펙트럼 긴 하루 photoperiod 빛 (16:8 빛: 어둠)과 고온 (20 ± 1 ° C) 부 화를 유도 하는 것을 decapsulated 계란을 노출 합니다. 해칭 48 h와 (최대 4; 몇 주 사이 발생 보조 비디오 4)입니다. Decapsulation의 부재, 직접 자극 (긴 하루 photoperiod 빛 (16:8 빛: 어둠)과 높은 온도 (20 ± 1 ° C)) 부 화를 ephippia를 노출 합니다. 4. 벼룩 마그나 의 Isoclonal 라인 구축 3.3 일회용 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 매체의 200 mL 가득 항아리를 별도의 단계에서 개별 디 마그나 를 전송 하 여 단일 파묻혀에서 isoclonal 라인을 설정 합니다. 각 개인은 성적인 재결합의 결과 되 고 유전으로 명료 하다. 재고 조건 10 ± 1 ° C, 16:8 빛: 다크 정권, 구성 된에서 무기한 isoclonal 라인 매주 0.2 mg C/L 클로렐라 vulgaris 또는 (예를 들어, Scenedesmus obliquus) 다른 녹색 조류의 먹이 유지 합니다. 매체 3 매주 갱신. 재고 조건 온도, 먹이 정권, 및 종으로 변경할 수 있습니다. 5. 주요 연구 참고: 두 개의 주요 연구의 설명 어떤 부활된 D.magna (하위)에서 호수 반지 (덴마크)의 퇴적암 아카이브에서 인구 온난화 진화 응답을 평가 하 되 제공 됩니다. 3 (하위) 인구는 다음 기간에서 부활 되었다: 1960-1970 년, 1970-1985 년, 및 > 1999. D. 마그나 퇴적암 아카이브 11 사이 58% (그림 4) 원거리에서 성공을 부 화. 각 timeperiod에서 얻은 파묻혀에서 여기에 설명 된 두 가지 주요 연구에 대 한 임의의 하위 집합 선택 되었다. 이러한 연구는 온도 기울기에 따라 서로 다른 기간에서 부활 (하위) 인구 차이 니스 연결 생활사 특성 (5.1)에 보였다 그리고 그들은 다른 경쟁 능력 (5.2) 했다를 평가 하기 위해 설계 되었습니다. 후 온난화에 노출. 그림 4: 호수 반지에서 샘플링 하는 퇴적암 보관에 성공을 부. 주요 연구에 사용 되는 호수 반지의 퇴적암 아카이브 따라 성공적인 파묻혀의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 일반적인 정원 실험 일반적인 정원 조건 주식 문화에서 (서브) 인구 당 10 파묻혀 전송: 16 ° C; 긴 photoperiod (16:8 빛: 다크 정권); 0.8 mg C/L 클로렐라 심상의 함께 매일 피드 및 갱신 매체 마다 둘째 날. 적어도 2 세대 (ca. 45 일)에 대 한 일반적인 정원 조건에 파묻혀 유지 합니다. 일반적인 정원 조건 모성 효과에서 간섭을 줄일 고 파묻혀 사이에서 복제를 동기화 할. 브루 드 챔버로 두 번째 무리의 방출, 전송 성인 여성 2 세대에서 500ml 단지 그들은 청소년의 두 번째 무리를 풀어 놓을 때까지 중간으로 가득. 24-48 h, 100 mL 단지 매체를 채워지고, 다음 실험 조건에 노출 2 세대의 두 번째 종족에서 태어난의 개별 청소년 무작위로 전송: 18 ° C (현재 온도 호수에서)와 (온난화, 온도 24 ° C 전망 26 IPCC 의해 곧 100 년), 16:8 빛: 다크 정권, 그리고 피드 매일 0.8 mg C/L Chlorellavulgaris의. 각 실험 동물에 머리와 꼬리 척추 (그림 5)의 사이의 거리도 크기는 stereomicroscope와 만기에 측정 합니다. 각 동물 사진 및 그 후 적당 한 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 그것의 크기를 분석. 성숙에 나이 측정: 하루에 계란 쪽 상공에 처음으로 관찰 된다. 사망률을 측정: 실험 기간 동안 멸종 개인의 수. 통치를 측정: 첫 번째 및 두 번째 클론 재생에 출시 하는 자손의 총 수. Euler의 방정식 (1)를 사용 하 여 추정 인구 증가율을 측정:(1)Lx 는 나이 x에서 생존의 비율, bx 세 x, 살아남은 개인 당 생산 신생아의 수 r 이며 자연 증가의 본질적인 비율입니다. 상용 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다. 여기에서, R31 를 사용 하 여 ggplot2 패키지를 사용 하 여 각 생활 역사 특색에 대 한 반응 규범 (환경에서 단일 유전자의 phenotypic 표정)를. 생존 분석 (R 패키지 rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf)를 통해 인구 당 사망률을 계산 합니다. 마지막으로, R31 특성에 온도 영향 진화 (인구 가운데 차이)에 의해 설명 될 수 있는지를 평가 하는 분산 분석 (ANOVA, 표 2)를 수행 소성 (치료에 응답), 또는의 진화 소성 (인구 치료 x). 경쟁 실험 일반적인 정원 조건 주식 문화에서 인구 당 10 파묻혀 전송: 20 ° C, 긴 photoperiod (16:8 빛: 다크 정권), 매일 0.8 mg C/L 클로렐라 vulgaris 의 피드 및 갱신 매체 마다 둘째 날. 모성 효과에서 간섭을 줄이기 위해 적어도 2 세대 (ca. 45 일)에 대 한 일반적인 정원 상태를 유지 합니다. 무작위로 할당 5 청소년 24 ~ 48 h의 각 hatchling의 두 번째 세대의 두 번째 종족에서 실험 mesocosms (중간 가득 20 L 플라스틱 aquaria), 10 동물/l.의 조밀도에 triplicates에서 24 ° c, 16:8 L:D 정권, mesocosms를 노출 하 고 매일 0.8 mg C/L Chlorellavulgaris 제어 온도 챔버 또는 최소 4 주에 대 한 보육의 먹이 (> 3 클론 세대). 컬링 각 mesocosm 매주 벼룩 자연 환경에서 발생할 수 있습니다 인구 동적 시뮬레이션을 매체의 10%를 새로 고침 합니다. 학살 하는 매체와 각 수족관 (이 경우 1.2 L)에서 동물의 알려진된 볼륨을 제거 하 여 하 고 신선한 매체와 학살된 볼륨을 대체 하 여 부과. 실험 동물 성숙 (10 일)에 도달 후 학살 정권을 시작 합니다. 4 주에의 끝에, 초기 inoculum 비교 genotypic 조성의 변화를 평가 하기 위해 각 mesocosm에서 32 동물 샘플. Microcentrifuge 튜브에서 개별 벼룩 을 놓고 파스퇴르 피 펫의 도움으로 과잉 액체를 제거 합니다. 플래시 동결 개별 튜브 액체 질소와-80 ° c.에 게 사용 가능한 프로토콜을 사용 하 고 제조업체의 지침에 따라 단일 개인 게놈 DNA를 추출 합니다. 유전자 마커 hatchling 당 독특한 multilocus 유전자 형을 제공 하기에 충분 한 수를 사용 하 여 추출 된 DNA를 증폭. 여기, 한 멀티플렉스 (M01, 표 1)에 배열 하는 8 나옵니다 설립된 프로토콜32,33다음 사용 되었다. 유전자 증폭 조각 분석기에 조각. 적당 한 크기의 표준을 사용 하 여 상업적 또는 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어와 조각 분석을 수행 합니다. 설명된33, 그리고 초기 inoculum 비교 실험의 끝에 각 유전자 형의 빈도 계산 microsatellite loci의 세트로 유전형 32 개인에 의해 실험의 끝에 genotypic 구성 평가. 그림 5: 성인 여성 벼룩 마그나. 성인 여성 벼룩 마그나 parthenogenetic 가만히 상공에서 된. 머리와 꼬리 척추의 기지 사이의 거리는 동물의 크기를 측정 하는 데 사용 됩니다. 빨간 줄 크기 측정을 나타냅니다. 눈금 막대 = 500 µ m.