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Environment

Auferstehung des ruhenden Daphnia Magna: Protokoll und Anwendungen

Published: January 19, 2018
doi:
10.3791/56637
,
1Environmental Genomics Group, School of Biosciences,University of Birmingham

Summary

Langzeitstudien sind unerlässlich, um den Prozess der Evolution und die Mechanismen der Anpassung zu verstehen. Diese Studien erfordern in der Regel, Verpflichtungen über die Lebensdauer der Forscher. Hier ist eine leistungsfähige Methode beschrieben, die State-of-the-Art-Datensammlung zum Generieren von Längsschnittdaten in natürlichen Systemen erheblich Fortschritte.

Abstract

Langzeitstudien ermöglicht die Identifizierung von Eco-evolutionäre Prozesse, die über längere Zeiträume auftreten. Darüber hinaus bieten sie wichtige empirische Daten, die verwendet werden können in Prognosemodelle, um evolutionäre Antworten der natürlichen Ökosysteme auf künftige Veränderungen der Umwelt zu prognostizieren. Allerdings sind außer wenigen Ausnahmefällen Langzeitstudien knapp wegen logistischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem Zugriff auf zeitliche Proben. Zeitliche Dynamik werden häufig im Labor oder in kontrollierten Mesokosmen Experimente mit außergewöhnlichen Studien untersucht, die die Entwicklung der natürlichen Populationen in freier Wildbahn zu rekonstruieren.

Hier wird eine Standardarbeitsanweisung (SOP) bereitgestellt, um wieder zu beleben oder wiederbeleben ruhenden Daphnia Magna, eine weit verbreitete Zooplankton Schlüsselspezies in aquatischen Ökosystemen, um drastisch die State-of-the-Art längs Datenerfassung im Voraus natürliche Systeme. Bereich der Auferstehung Ökologie wurde 1999 von Kerfoot und Mitarbeitern, definiert, obwohl die ersten am ruhenden Zooplankton Eiern reichen zurück bis in den späten 1980er Jahren schlüpfen Versuche. Da Kerfoots Samen-Papier ist die Methodik der Wiederbelebung Zooplankton Arten immer häufiger angewendet worden, obwohl Labors nur über direkten Wissenstransfer propagiert. Hier wird eine SOP beschrieben, die eine schrittweise auf die Praxis Protokoll der Wiederbelebung ruhender Daphnia Magna Eiern.

Zwei wichtige Studien werden in die Fitness-Antwort von Daphnia Magna Bevölkerungen zu auferstanden Erwärmung gemessen wird, aufbauend auf die Fähigkeit, historische und moderne Bevölkerungen in den gleichen Einstellungen zu studieren. Schließlich ist die Anwendung der nächsten Generation Sequenziertechnologien wiederbelebt oder noch ruhenden Stadium diskutiert. Diese Technologien bieten beispiellose macht in sezieren die Prozesse und Mechanismen der Evolution, wenn für die Bevölkerung angewendet, die Veränderungen der Selektionsdruck im Laufe der Zeit erlebt haben.

Introduction

Langzeitstudien sind entscheidend für das Verständnis ökologische und evolutionäre Prozesse in der Natur und bei der Beurteilung, wie Arten reagieren und bleiben während der Umweltveränderungen1. Und zwar deshalb, weil Eco-evolutionäre Prozesse über Generationen hinweg geschehen und Veränderungen in der Umwelt, über lange Zeiträume auftreten. Darüber hinaus bieten Langzeitstudien wichtige Erfahrungswerte, die Verbesserung der Genauigkeit der prädiktive Modellierung, evolutionäre Antworten der natürlichen Ökosysteme auf Veränderungen der Umwelt2zu prognostizieren. Die Genauigkeit dieser Modelle ist entscheidend für die Bewirtschaftung und Erhaltung Strategien zur Erhaltung der Biodiversität und Ökosystemdienstleistungen umzusetzen.

Außer wenigen Ausnahmefällen (z.B. Galapagos Darwin Finken3 und Algen4) sind langfristige Studien weitgehend nur die Arten mit kurzen Generationszeit, die im Labor5,6 propagiert werden kann , 7 , 8. die evolutionäre Dynamik zugrunde liegenden Prozesse bleiben daher, schwer fassbar. Wegen logistischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem Zugriff auf zeitliche Muster empirische Daten werden immer häufiger in eine räumliche als in einem zeitlichen Zusammenhang untersucht und zeitliche Eco-evolutionäre Prozesse abgeleitet oder aus räumlichen Daten modelliert. Dieser Ansatz wird als “Raumzeit” Substitution9, bezeichnet wobei Raum als Surrogat zeitliche evolutionäre Dynamik angenommen wird. Die wichtigste Einschränkung der “Raumzeit” Substitution ist, dass zeitliche Variation in der gleichen Bevölkerung Raten von Anpassung auf verschiedenen räumlichen Ebenen unterscheiden; Daher sind Rückschlüsse basierend auf Ersatz der Zeit mit dem Raum voreingenommene10.

Eine leistungsfähige Alternative, die ermöglicht die Untersuchung evolutionäre Dynamik in natürlichen Ökosystemen im Laufe der Zeit ist die Analyse der ökologischen und genetischen Veränderungen in Herstellung von ruhenden Phasen11Arten. Diese ruhenden Phasen sammeln in Form geschichtet biologische Archive, die genau datiert werden können und Paleolimnologically gekennzeichnet12,13. Wichtig ist, können diese ruhenden Stadien wieder zum Leben erweckt und verwendet in Laborversuchen, wo ihre evolutionäre Reaktion auf Veränderungen der Umwelt direkt gemessen werden. Historische Bevölkerungen können gegen ihre modernen entwickelten Nachkommen Fitness Änderungen und die Funktion von Genen entwickelt sich im Gleichschritt mit Umweltveränderungen14,15,16studieren antrat.

Ruhende Stadien sind Samen, Zysten, Sporen und Ei Banken. Obwohl die ersten Studien über wiederauferstandene ruhenden Eiern stammt aus den späten 1980er Jahren17und eine Handvoll Studien dieser Technik in den frühen 1990er Jahren18,19angewendet haben, wurde der Bereich der Auferstehung Ökologie formell von der Samen-Papier Kerfoot und Mitarbeiter in 199920gegründet. Diese Praxis wurde vor allem in Paleolimnological Rekonstruktionen von Süßwasserfischen17,21,22angewendet. Eine SOP ist jedoch noch nicht verfügbar. Hier ist eine schrittweise Beschreibung des Protokolls Auferstehung auf ruhende Eiern der Gattung Zooplankton Daphnia Magna angewendet, von der Probenahme von Sedimenten, die Einrichtung von klonalen Kulturen von Jungtiere zur Verfügung gestellt. Schritte der SOP, die sind ohne weiteres übertragbar auf andere Arten von Daphnien,sowie Schritte, die zusätzliche Optimierung erfordern werden diskutiert.

Daphnien sind bei den meisten lotic Lebensräume23 Süßwasser Zooplankters. Daphnien -Arten sind entweder obligat asexuell oder zyklische Parthenogens. D. Magna ist eine zyklische Parthenogen, die unter günstigen Umweltbedingungen24klonal reproduziert. Wenn die Umweltbedingungen verschlechtern, männliche Produktion erfolgt und sexuelle Rekombination führt zur Bildung von befruchteten Eizellen, die einen der Vegetationsruhe aus der Umgebung durch einen Chitin-Fall genannt Ephippium geschützt Zustand. Ein Teil dieser ruhenden Eier schlüpfen bei günstigen Umweltbedingungen zurück. Ein Großteil der ruhende Ei Bank hat jedoch nie eine Chance zu schlüpfen und damit biologische Archiv im Laufe der Zeit aufbauen. Ruhende Stadien bleiben in den Sedimenten von Seen und Teichen begraben und können über längere Zeiträume für das Studium der evolutionäre Dynamik wiederbelebt werden. Da ruhende Eiern von D. Magna sexuelle Rekombination resultieren, sind sie eine gute Darstellung der natürlichen genetischen Vielfalt der Arten25. Darüber hinaus können sie über klonalen Vermehrung im Labor gewartet werden. Diese Eigenschaften bilden den einzigartigen Vorteil der isogenen Modellorganismen, unter Beibehaltung der natürlichen genetischen Vielfalt.

Zwei wichtige Studien werden vorgestellt, um die Vorteile der direkten Vergleich historische und moderne Nachkommen der gleichen Bevölkerung D. Magna zu demonstrieren Umwelt Selektionsdruck im Laufe der Zeit zu erleben. D. Magna Exemplare wurden vom See Ring (Dänemark), eine flache auferweckt (5 m Tiefe; Oberfläche 22 ha) gemischte Teich, die eine Erhöhung der durchschnittlichen Temperatur und Hitzewellen auftreten im Laufe der Zeit erlebt hat. D. Magna (Teil-) Populationen wurden entlang dieser zeitlichen Verlauf von 60 Jahren (1960 – 2005) wiederbelebt und untersucht, um evolutionäre Reaktion auf Temperatur Erwärmung zu untersuchen. In der ersten Studie in einem gemeinsamen Garten Experiment wurden Änderungen in Fitness-linked Lebensgeschichte Eigenschaften als Reaktion auf eine Erhöhung der Temperatur von + 6 ° C, in Übereinstimmung mit den Vorhersagen des zwischenstaatlichen Ausschusses für den Klimawandel für die nächsten 100 Jahre gemessen. 26. in der zweiten Studie wurde eine Mesokosmen-Experiment zur wettbewerbsfähigen Fähigkeiten der drei Messen (Teil-) Populationen unter Erwärmung. Diese Experimente in Kombination zeigen, dass in Gegenwart der Erwärmung als des einzige Stress, alle Lebensgeschichte Züge und Populationen ein hohes Maß an Plastizität zeigen und gleiche wettbewerbsfähige Fähigkeiten haben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Erwärmung, da eine einzelne Stress keine signifikante Fitnesskosten mindestens in der Bevölkerung hier studiert.

Protocol

Die folgende SOP enthält eine schrittweise Beschreibung des Protokolls verwendet, Daphnia Magna wiederbeleben ruhende Eiern, einschließlich einer detaillierten Beschreibung der Probenahme, Isolierung des Ephippien aus dem Sediment und Einrichtung von klonalen Kulturen ( Abbildung 1). Abbildung 1: schrittweise Anleitung für die Auferstehung des Daphnia Magna. Sediment aus Süßwasser Lebensraum (A) wird mit einem Kolben Corer (B) gesampelt. Sedimentkern (C) wird in inkrementelle Schichten von 1 oder 0,5 cm (D) geschnitten. Jede Schicht des Sediment wird in einer Probe Zip-Lock Beutel (E) in dunklen und kalten Bedingungen (4 ° C) gespeichert. Jede Schicht der Sedimente wird gewogen und gesiebt mit geologischen Siebe (1 mm und 125 µm Maschenweiten, F). Weißem Hintergrund Tabletts dienen, Daphnia Magna Ephippien (G) zu isolieren. Decapsulated ruhende Eiern (H) sind auf Petrischalen übertragen und ans Licht und Temperatur Reize um Schlupf zu induzieren. Jungtiere werden übertragen, um Gläser (ich) Isoclonal Linien zu trennen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 1. Probenahme von Sedimentkernen Probe Sediment aus Seen oder Teiche mit einem Kolben Corer. Dieses Protokoll verwendet Big Ben27, ein Kernrohr von ca. 1,5 m Länge mit einem internen Rohrdurchmesser von 14 cm. Big Ben besteht aus einem Kolben auf einem Seil und einem Corer Kopf, auf die Stäbe befestigt sind, um das Rohr in das Sediment zu fahren. Eine Core-Catcher hilft die Unterstützung von dem Kernrohr wenn Sie voll von Sedimenten. Um das Sediment extrudieren, ein Rahmen hält dem Kernrohr aufrecht und stationär, und ein modifizierte Flasche Jack wird verwendet, um den Kolben nach oben während der Extrusion (ergänzende Video 1) schieben. Verwenden Sie für flache Tümpel von weniger als 1 m in die Tiefe eine Plexiglas-Schwerelot von nicht mehr als 6 cm Durchmesser manuell in das Sediment geschoben. Für tiefen Seen (> 6 m Tiefe), Livingston Kolben Corers28 oder einem Laufwerk Griffith Sediment Corers mit Aids von einem verankerten Ponton-Boot verwenden. Livingstone-Typ Antrieb Stab Kolben Corer kann in Wasser bis zu ca. 30 m tief, aufeinander folgende ein-Meter-Laufwerke aus weichem, konsolidierte See Sediment zu sammeln verwendet werden. Single-Drive Griffith Corer besteht aus einem einfachen, aber robusten Kern-Kopf, der standard Polycarbonat Rohre mit Livingstone Antriebsgestänge verbindet. Die Corers werden in das Sediment mit den Stangen geschoben und ein Kolben sorgt für die Absaugung für die Wiederherstellung von Sedimenten (Abbildung 2). Zum Abrufen von kontinuierlichen, nutzen ungestört Kerne Vibracoring. Diese Corers arbeiten an einer Vielzahl von Wassertiefen und Kernproben von verschiedenen Längen, je nach Sediment Lithologie abrufen können. Niedrige Amplitude Schwingung, die von dem Vibracore Kopf nach unten durch die beigefügten Fass oder Kernrohr übertragen wird verflüssigt Sedimente, damit des Kern-Laufes befestigt die Vibracore Einheit in der verflüssigten Sedimente eindringen. Einige Vibracorers sind klein, leicht und tragbar, andere große schwere Einheiten, die nur von großen Schiffen eingesetzt werden können. Die Wahl des Corers hängt von der Lithologie von Sedimenten. Schneiden Sie den Kern horizontal in inkrementelle Schichten von 1 cm oder weniger mit einer flachen Metalloberfläche (ergänzende Video 1). Sediment Corers wie den hier sind zur Reduzierung der hydrostatische Druck in Extrusion, Verringerung der Störung von der Sedimentschichten. Wenn andere Corers verwendet werden, kann mit einer Art Cookie-Cutter-Klinge, Kontamination zwischen Schichten zu begrenzen die äußere Rinde jedes Sedimentschicht entfernt werden. Jede Sedimentschicht in einem separaten Auffangbeutel (ergänzende Video 1) sammeln, und Bedingungen in dunkel und kalt (4 ° C) aufbewahren. Sammeln Sie ein Minimum von 5 g von Sedimenten aus allen Schichten für die radiometrische Datierung. Radiometrische Datierung ist eine etablierte Protokoll für eine detaillierte Beschreibung des Dativ Assays, beziehen sich auf bestehende Publikationen12,13. Abbildung 2: Cartoon des Kolbens Entkernung Verfahren. Kolben Corer, ein hohles Rohr mit einer internen gleitenden Dichtung (Kolben), die ein schwaches Vakuum erzeugt. Wenn der Kolben die Sediment-Wasser-Grenzfläche berührt, das Gewicht drückt den Kern-Lauf in das Sediment und das Vakuum bewirkt, dass das Sediment wird entkernt und bewegen sich das Rohr ohne zu stören die Sedimentschichten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 2. Siebung der Sedimentschichten Mit einer Präzisionswaage, wiegen Sie jeder Sedimentschicht zu Referenzzwecken. Verwenden Sie die Fläche und Gewicht zur Berechnung der Dichte der Arten im See. Sieb jedes Sedimentschicht mit zwei geologische Siebe übereinander gestapelt. Das erste Sieb hat eine Maschenweite von 1 mm und den Rest des Sediments Ton, große Wirbellose und Feinstaub, z.B. Saatgut, Pflanzen und Insekten, trennt. Das zweite Sieb verfügt über ein Netz von 125 µm und trennt D. Manga Ephippien und kleine Partikel aus dem Rest des Sediments (ergänzende Video 2). Transfer kleine Aliquote der Sediment-Fraktion gesammelt auf 125 µm-Sieb auf einem weißen Hintergrund-Tablett. Je nach Art der Sedimente können kleinere oder größere Aliquote von Sedimenten zu jeder Zeit übertragen werden. Fügen Sie kleine Mengen (bis zu 200 mL) des Mediums in die Probenahme weiß Ablage neu übertragenen Sediment Bruchteil auszusetzen und zu erleichtern, Auge spotting des Ephippien (Abbildung 3). Das Medium verwendet, um das Sediment aufzuwirbeln kann ungechlortem Wasser aus dem Wasserhahn, Bohrloch Wasser, COMBO29oder ADaM Medium (Aachener Daphnien)30sein. Im folgenden wird der Begriff “Medium” bezieht sich auf eine oder alle der aufgeführten Lösungen verwendet werden. Abbildung 3: Daphnia Magna Ephippium. Ruhende Daphnia Magna Eiern unmittelbar nach Delamination. Ephippium (A), die innere Eihülle (B) und die ruhenden Eiern (C) ergeben sich. Maßstabsleiste = 500 µm. (3) Delamination von Ephippien und Schraffur Mit einer Einweg-Pasteurpipette oder mit Mikrodissektion Pinzette Übertragung einzelner Ephippien, Petrischalen mit 10 mL Medium gefüllt. Verwenden Sie mindestens eine Petrischale pro Sedimentschicht. Unter dem Stereo-Mikroskop, Decapsulate jedes Ephippien mit Mikrodissektion Pinzette durch zwingen öffnen der Chitin-Fall (ergänzende Video 3). Entfernen Sie den ruhenden inneren Eihülle zart, Aufmerksamkeit auf die Eiern nicht zu stören und übertragen Sie sie auf der Petrischale mit Medium mit einer Pasteurpipette gefüllt. Delamination erhöht Schlupferfolg in D. Magna; aber, es ist möglicherweise nicht erforderlich oder kann es für andere Daphnien -Arten produzieren kleinere Ephippien eine Herausforderung sein. Setzen Sie die Decapsulated Eiern, eine Vollspektrum lange Photoperiode Tageslicht (16:8 hell: dunkel) und hoher Temperatur (20 ± 1 ° C) induzieren schlüpfen in ein kontrollierter Temperatur Gerät (Inkubator) oder ein Zimmer. Schlupf auftritt zwischen 48 Stunden und mehreren Wochen (bis zu vier; Zusätzliche Video 4). In Abwesenheit von Delamination direkt aussetzen der Ephippien, Schraffur Reize (lange Photoperiode Tageslicht (16:8 hell: dunkel) und hoher Temperatur (20 ± 1 ° C)). 4. Festlegung Isoclonal Daphnia magna Schaffen Sie Isoclonal Linien von einzelnen Jungtiere durch die Übertragung von einzelnen D. Magna ab Schritt 3.3 Gläser gefüllt mit 200 mL Medium mit einer Einweg-Pasteurpipette zu trennen. Jedes Individuum unterscheidet sich genetisch, als Folge der sexuellen Rekombination. Pflegen Sie Isoclonal Linien auf unbestimmte Zeit in Bestandslage bestehend aus 10 ± 1 ° C, 16:8 hell: dunkel Regime, wöchentlich mit 0,2 mg C/L von Chlorella Vulgaris oder andere Grünalgen (z. B. Scenedesmus Obliquus) gefüttert. Jede dritte Woche des Mediums zu erneuern. Bestandslage können mit Temperatur, Fütterung, Regime und Arten ändern. 5. wichtige Studien Hinweis: Eine Beschreibung der beiden wichtigsten Studien erfolgt in dem auferstandenen D.magna (Teil-) Populationen aus sedimentären Archiv von See Ring (Dänemark) verwendet werden, um die evolutionäre Reaktion auf Erwärmung zu beurteilen. Drei (Teil-) Populationen wurden auferweckt von den folgenden Zeiträumen: 1960-1970, 1970-1985, und > 1999. D. Magna schlüpfen Erfolg aus der sedimentären Archiv lag zwischen 11 und 58 % (Abbildung 4). Aus der Jungtiere aus jedem Zeitfenster gewonnen war eine zufällige Teilmenge für zwei wichtigen Studien, die hier beschriebenen gewählt. Diese Studien wurden entwickelt, um festzustellen, ob (Teil-) Populationen aus verschiedenen Zeiträumen entlang der Temperaturgradient auferstanden zeigten Unterschiede in der Fitness-linked Lebensgeschichte Züge (5.1) und ob sie hatten unterschiedliche wettbewerbsfähige Fähigkeiten (5.2) nach Exposition gegenüber Erwärmung. Abbildung 4: Schraffur Erfolg in einem sedimentären Archiv von See Ring abgetastet. Der Anteil der erfolgreichen Jungtiere entlang der sedimentären Archiv der See Ring in den wichtigsten Studien verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Gemeinsamer Garten Experimente Übertragen Sie zehn Jungtiere pro (Sub) Bevölkerung von Stammkulturen auf gemeinsamen Garten Bedingungen: 16 ° C; lange Photoperiode (16:8 hell: dunkel Regime); füttern Sie täglich mit 0,8 mg C/L von Chlorella Vulgaris, und erneuern Sie Medium jeden zweiten Tag. Pflegen Sie die Jungtiere im gemeinsamen Garten Bedingungen für mindestens zwei Generationen (ca. 45 Tage). Gemeinsame Garten Bedingungen Störungen aus dem mütterlichen Effekt reduzieren und Reproduktion unter Jungtiere zu synchronisieren. Nach der Freisetzung der zweiten Brut in den Brutraum transfer adulte Weibchen aus der zweiten Generation auf 500 mL Gläser mit Medium gefüllt, bis sie die zweite Brut von Jungfischen release. Nach dem Zufallsprinzip übertragen einzelne Jungtiere von 24 – 48 h, geboren aus der zweiten Brut der zweiten Generation, auf 100 mL Gläser mit Medium gefüllt und die folgenden experimentellen Bedingungen ausgesetzt: 18 ° C (aktuelle Temperatur im See) und 24 ° C (Erwärmung, Temperatur Die IPCC- 26 für die nächsten 100 Jahre prognostizierten), 16:8 hell: dunkel Regime und Futter täglich 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris. Messen Sie auf jedes Versuchstier die Größe am Ende der Laufzeit mit einem Stereomikroskop als der Abstand zwischen dem Kopf und das Ende der Rute Wirbelsäule (Abbildung 5). Jedes Tier zu fotografieren und anschließend seine Größe mit einem geeigneten Bild-Software analysieren. Das Alter am Ende der Laufzeit zu messen: der Tag in dem Eiern zum ersten Mal in den Brutraum eingehalten werden. Die Sterblichkeit zu messen: die Zahl der ausgestorbenen Personen während des Experiments. Messen die Fruchtbarkeit: die Gesamtzahl der Nachkommen im ersten und zweiten klonalen Vermehrung veröffentlicht. Messen Sie die Wachstumsrate der Bevölkerung, unter Verwendung der Euler-Gleichung (1) geschätzt:(1)Wo lX der Anteil des Überlebens im Alter X ist, ist bX die Zahl der Neugeborenen pro überlebende Person im Alter Xproduziert, und r ist die intrinsische Rate der natürlichen Zunahme. Führen Sie statistische Analyse mit im Handel erhältlichen Software. Verwenden Sie R31 , um die Reaktion Normen (Phänotyp einer einzigen Genotyp in Umgebungen) für jede Lebensgeschichte Merkmal, mit dem ggplot2-Paket zu plotten. Sterblichkeitsrate pro Einwohner über Überlebensanalyse (R Paket rms; https://cran.r-project.org/web/packages/rms/rms.pdf) zu berechnen. Zu guter Letzt führen eine Varianzanalyse (ANOVA, Tabelle 2) in R31 zu beurteilen, ob der Einfluss der Temperatur auf Eigenschaften von der Evolution (Unterschiede zwischen Populationen), erklärt werden kann Plastizität (Ansprechen auf die Behandlung) oder Evolution Plastizität (Bevölkerung x Behandlung). Wettbewerb-experiment Übertragen Sie zehn Jungtiere pro Einwohner von Stammkulturen auf gemeinsamen Garten Bedingungen: 20 ° C, lange Photoperiode (16:8 hell: dunkel Regime), täglich mit 0,8 mg C/L von Chlorella Vulgaris, füttern und Medium jeden zweiten Tag zu erneuern. Pflegen Sie gemeinsame Garten Bedingungen für mindestens zwei Generationen (ca. 45 Tage), Störungen durch mütterliche Effekte zu reduzieren. Nach dem Zufallsprinzip weisen Sie fünf Jungtiere von 24 bis 48 h aus der zweiten Brut von der zweiten Generation jedes Jungtier experimentelle Mesokosmen (20 L Kunststoff Aquarien mit Medium gefüllt) zu, in Triplicates, in einer Dichte von 10 Tiere/L. Aussetzen der Mesokosmen auf 24 ° C, 16:8 L:D Regime, und mit 0,8 mg C/L Chlorellavulgaris in einer kontrollierten Temperatur Kammer oder Inkubator für mindestens vier Wochen täglich füttern (> 3 klonalen Generationen). Keulen Sie jedes Mesokosmen wöchentlich, erfrischende 10 % des Mediums, eine Bevölkerung Dynamik simulieren, die Daphnien in der natürlichen Umgebung auftreten können. Keulung von einem bekannten Volumen des Mediums und Tiere aus jedem Aquarium (1,2 L in diesem Fall) zu entfernen und durch den Austausch der gekeulten Volumens mit frischem Medium zu verhängen. Das culling-Regime nach der Versuchstiere ausgewachsen (Tag 10) gestartet. Am Ende der vierten Woche Probe 32 Tiere aus jeder Mesokosmen Verschiebungen in genotypischen Zusammensetzung im Vergleich zu den ursprünglichen Inokulum zu beurteilen. Einzelnen Daphnien in Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Hilfe einer Pasteurpipette. Flash Einfrieren Einzelrohre in flüssigem Stickstoff und Store bei-80 ° C. Einzelne Individuen mit verfügbaren Protokolle und Anweisungen des Herstellers extrahieren Sie genomischen DNA. Verstärken Sie die extrahierte DNA mit einer Reihe von genetischen Markern ausreicht, um eine einzigartige multilocus Genotyp pro Jungtier. Hier dienten nach etablierte Protokolle32,338 Mikrosatelliten, angeordnet in einem einzigen Multiplex (M01, Tabelle 1). Genotyp verstärkt Fragmente zu einem Fragment Analyzer. Durchführen Sie Fragment-Analyse mit einer kommerziellen oder frei verfügbare Software mit einem Standard-geeignete Größe. Genotypischen Zusammensetzung am Ende des Experiments durch Genotypisierung der 32 Personen mit einer Reihe von Mikrosatelliten-Loci beschrieben33, sowie Berechnung der Häufigkeit von jeder Genotyp am Ende des Experiments im Vergleich zu den ursprünglichen Inokulum zu beurteilen. Abbildung 5: Erwachsenfrau Daphnia Magna. Erwachsene weibliche Daphnia Magna Parthenogenetische Eier in den Brutraum. Der Abstand zwischen dem Kopf und das Ende der Rute Wirbelsäule wird verwendet, um die Größe des Tieres zu messen. Die roten Linien zeigen die Größenmessungen. Maßstabsleiste = 500 µm.

Representative Results

Langfristige empirische Daten sind entscheidend für das Verständnis der evolutionäre Dynamik und Ausdauer der natürlichen Populationen. Diese Daten sind in der Regel schwierig, aufgrund logistischer Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Zugriff auf zeitliche Proben und das Erfordernis der langfristigen Datenerhebung zu begehen. In den beiden wichtigsten Studien hier präsentiert ist empirische Beweise für die Reaktion auf die Temperatur von einem zentralen Zooplankter in Süßwasser-Ökosystemen über evolutionäre Zeiträume zur Verfügung gestellt. Dies ist durch die Verwendung von geschichteten ruhende Ei Banken aktiviert, die die Möglichkeit bieten, die Reaktion der historische Bevölkerungen und ihre modernen Nachkommen auf Umweltstress in allgemeine experimentelle Einstellungen zu studieren. Gemeinsamer Garten experimentDer gemeinsame Garten Experiment zeigte, dass alle Merkmale der Lebensgeschichte auf Temperatur reagiert (Abbildung 6 und Abbildung 7). Die ANOVA-Analyse ergab, dass alle (Teil-) Populationen auf Temperatur über Plastizität (Tabelle 2), mit Ausnahme von Sterblichkeit, reagieren nicht mehr reagiert. Evolutionäre Veränderungen (Unterschiede zwischen (Teil-) Populationen) verzeichneten nur Bevölkerungswachstum (Tabelle 2), die in zwei der drei deutlich zugenommen (Teil-) Populationen bei 24 ° C (Abbildung 6). Abbildung 6: gemeinsame Garten Experiment. Reaktion Normen für Lebensgeschichte Eigenschaften (Fruchtbarkeit, Größe und Alter am Ende der Laufzeit) und Bevölkerungswachstum (R) werden für jedes (Teil-) Bevölkerung unter Temperatur Erwärmung (24 ° C) im Vergleich zu den gemeinsamen Garten und aktuelle Temperatur-Regime (18 ° C) angezeigt. Die Wachstumsrate der Bevölkerung “R” wird anhand der Eulerian Gleichung (1). Konfidenzintervalle werden angezeigt. (Teil-) Populationen sind farblich gekennzeichnet: blau (i): 1960-1970; (Ii) grün: 1970 – 1985; (Iii) rot: > 1999. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7: Mortalität. Sterblichkeitsrate pro (Sub) Bevölkerung (1960-1970; 1970-1985; > 1999) unter Erwärmung (24 ° C) im Vergleich zu modernen Temperaturregime (18 ° C) ausgewiesen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Mesokosmen-experimentNach vier Wochen der Auswahl, vertreten durch die Erwärmung bei 24 ° C, die Häufigkeit der drei (Teil-) Populationen änderte sich nicht signifikant (χ2 = 0,55, P = 0,76) im Vergleich zu den ursprünglichen Inokulum (Abbildung 8). Unter den 30 Genotypen im Experiment Mesokosmen geimpft wurde die Mehrheit nach vierwöchiger Auswahl (Abbildung 9) identifiziert. Konkret wurden 70 % der geimpften Genotypen erholt, kompatibel mit Poisson Erwartung der Wiederherstellung mindestens einen Vertreter jeder Genotyp in einer Stichprobe von 32 Personen. Abbildung 8: Wettbewerb Experiment – Bevölkerung Frequenz. Bevölkerung im Durchschnitt Median und Quartile (25th und 75th), ist für die drei gezeigt (Teil-) Populationen von D. Magna nach vierwöchiger Auswahl in Mesokosmen Wettbewerb Experimente (24 ° C), im Vergleich zu einer anfänglichen gleicher Häufigkeit (bei der Anfang). (Teil-) Populationen sind farblich gekennzeichnet, wie in Abbildung 6dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9: Wettbewerb Experiment – Genotyp Frequenz. Genotyp-Frequenzen – gemittelten Median und Quartile (25th und 75th), ergeben sich nach vier Wochen nach der Exposition gegenüber Erwärmung (24 ° C) im Vergleich zu eine anfängliche gleicher Häufigkeit der Genotypen (gestrichelte Linie). Namen auf der x-Achse sind die beimpften Genotypen-ID gruppiert pro (Sub) Bevölkerung (blau, 1960-1970; grün, 1970-1985; rot, > 1999). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Locus EIN Größenbereich (bp) Primer (5′ – 3′) Farbstoff-label Motiv zu wiederholen TM B008 HQ234154 150 – 170 F: TGGGATCACAACGTTACACAA VIC (TC) 9 56 R: GCTGCTCGAGTCCTGAAATC B030 HQ234160 154-172 F: CCAGCACACAAAGACGAA HAUSTIER (GA) 11 56 R: ACCATTTCTCTCCCCCAACT B045 HQ234168 118 – 126 F: GCTCATCATCCCTCTGCTTC NED (TG) 8 56 R: ATAGTTTCAGCAACGCGTCA B050 HQ234170 234-248 F: TTTCAAAAATCGCTCCCATC 6FAM (GAA) 6 56 R: TATGGCGTGGAATGTTTCAG B064 HQ234172 135 – 151 F: CTCCTTAGCAACCGAATCCA 6FAM (TC) 8 56 R: CAAACGCGTTCGATTAAAGA B074 HQ234174 196 – 204 F: TCTTTCAGCGCACAATGAAT NED (GT) 9 56 R: TGTGTTCCTTGTCAACTGTCG B096 HQ234181 234-240 F: GGATCTGGCAGGAAGTGGTA VIC (AC) 15 56 R: TTGAACCACGTCGAGGATTT B107 HQ234184 250 – 274 F: GGGGTGAAGCATCAAAGAAA HAUSTIER (CT) 8 56 R: TGTGACCAGGATAAGAGAAGAGG Tabelle 1: Mikrosatelliten Multiplex. Der NCBI Beitritt Anzahl (AN), die Multiplex-Informationen, die PCR-Primer-Sequenzen, die PCR Größenbereich, das wiederkehrende Motiv der Farbstoff verwendet, um die Beschriftung, die der forward Primer und die Anlasstemperatur (Tm) angezeigt werden. Pop-Wachstumsrate (R) DF F P Evolution (Pop) 2 30.309 < 0,001 Plastizität (Temp) 1 531.546 < 0,001 Evol. Plastizität (Pop-X Temp) 2 65.137 < 0,001 Sterblichkeit DF F P Evolution (Pop) 2 2.234 0.1162 Plastizität (Temp) 1 2.679 0.1071 Evol. Plastizität (Pop-X Temp) 2 1.8657 0,164 Fruchtbarkeit DF F P Evolution (Pop) 2 1.8852 0.1633 Plastizität (Temp) 1 6.8934 0.0117 Evol. Plastizität (Pop-X Temp) 2 1.6511 0.203 Größe am Ende der Laufzeit DF F P Evolution (Pop) 2 0.211 0.8106 Plastizität (Temp) 1 11.1361 0.0017 Evol. Plastizität (Pop-X Temp) 2 0.6586 0.5225 Alter am Ende der Laufzeit DF F P Evolution (Pop) 2 0.7811 0.4637 Plastizität (Temp) 1 8.0764 0.0066 Evol. Plastizität (Pop-X Temp) 2 0,088 0.9159 Tabelle 2: Analyse der Varianz (ANOVA). Analyse der Varianz zu testen, ob Veränderungen in der Lebensgeschichte Züge und Bevölkerungswachstum der auferstandene (Teil-) Populationen zur Erwärmung ausgesetzt durch evolutionäre Anpassung (Populationen), Plastizität (Temperaturbehandlung), erklärt sind und ihre Wechselwirkungsterm (Entwicklung der Plastizität). Signifikanten p-Werten (p< 0,05) werden fett dargestellt. Ergänzende Video 1: Probenahme von Sedimentkernen. Die Verwendung von einem Big Ben Corer wird angezeigt. Big Ben ist ein Kernrohr von ca. 1,5 m Länge mit einem internen Rohrdurchmesser von 14 cm. Es besteht aus einem Kolben auf einem Seil und einem Corer Kopf, auf die Stäbe befestigt sind, um das Rohr in das Sediment zu fahren. Eine Core-Catcher wird verwendet, um dem Kernrohr zu unterstützen, die von einem kleinen Schiff bereitgestellt wird. Der Kolben in das Sediment durch Gravitationsdruck nach unten gedrückt. Ein Rahmen wird verwendet, um dem Kernrohr zu unterstützen, während der Extrusion durchgeführt mit einem modifizierten Flasche Jack, der den Kolben nach oben drückt. Jedes Sedimentschicht gesammelt auf einer flachen Metalloberfläche und auf transparenten Probenahme Taschen für langfristige Lagerung übertragen [dunkel und kalt (4 ° C) Bedingungen]. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen. Ergänzende Video 2: Sediment Siebung. Die notwendige Ausstattung für Siebung Sediment ist eine Präzisionswaage, weiße Probenahme Trays und geologischen Siebe. Aus jeder Sedimentschicht sind mindestens 5 g für die radiometrische Datierung beibehalten. Der Rest des Sediments wird verwendet, um Ephippien zu isolieren. Das Sediment wird durch zwei geologische Siebe, eins mit 1 mm und eine zweite mit 125 µm Maschenweite übereinander gestapelt gesiebt. Medium wird auf 1 mm-Sieb, Lehm, große Wirbellose und Feinstaub zu trennen gegossen. Medium auf das zweite Sieb mit 125 µm Maschenweite gegossen trennt D. Magna Ephippien und kleine Partikel. Aliquote von Sedimenten werden dann auf einem weißen Probenahme Tablett übertragen. D. Magna Ephippien sind von Auge in den weißen Hintergrund Fach entdeckt. Ephippien aus jeder Schicht werden in separaten Petrischalen gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen. Ergänzende Video 3: Delamination. Unter einem Stereomikroskop werden durch Druck auf die Wirbelsäule des Falles Chitin D. Magna Ephippien mit Mikrodissektion Zange geöffnet. Die innere Eihülle vorsichtig entfernt und Dauereier sanft mit einer Pasteurpipette auf einer Petrischale mit 10 mL Medium übertragen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen. Ergänzende Video 4: schraffieren. Nach Exposition gegenüber einer langen Photoperiode und 20 ° C wird die Entwicklung des Embryos zwischen 48 Stunden und Wochen fortgesetzt. Wenn die Entwicklung abgeschlossen ist, die Embryonen befreien von der Eierschale und frei schwimmen im Medium. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Wegen der hohen Wärmeleitfähigkeit des Wassers sind Süßwasser-Ökosystemen34höheres Risiko von Verlust der biologischen Vielfalt als terrestrische Ökosysteme angesichts der globalen Erwärmung. Es ist daher entscheidend für die Reaktion der Schlüsselarten in diesen Ökosystemen zu verstehen und identifizieren Bewältigungsmechanismen um thermische Belastung zu überleben. Das Verständnis dieser Mechanismen auf Arten und gemeinschaftlichen Ebene kann helfen, vorherzusagen, wie Arten von der Erderwärmung betroffen sind und wie die Auswirkungen auf die einzelnen Arten zu anderen trophischen Ebenen Kaskaden. Letztlich, Verständnis der Mechanismen der Antworten auf die globale Erwärmung ermöglicht die Identifizierung von Sanierungsstrategien, Aussterben zu mildern.

Die hier vorgestellten Fallstudien zeigen, dass die Antwort von D. Magna zu Temperaturanstieg durchdringend durch Plastizität in Lebensgeschichte Eigenschaften vermittelt wird und Reaktion auf Temperaturerhöhung alleine nicht klar Fitnesskosten aufbürdet zumindest in der Bevölkerung studiert hier. Hohe Plastizität in Lebensgeschichte Eigenschaften wird durch nicht-signifikanten Unterschiede in der konkurrierenden Fähigkeiten der (Teil-) Populationen in Anwesenheit von Erwärmung unterstützt. Jedoch möglicherweise längerfristige Wettbewerb Experimente auf mehrere Populationen notwendig, diese Befunde zu verallgemeinern.

Auferstehung des ruhenden Phasen bietet eine noch nie da gewesenen Ressource um Mechanismen der Anpassung und Flugbahnen von einer Art Evolution durch Zeit10zu studieren. Zooplankton Arten profitieren von einer schnellen Generationszeit (ca. 2 Wochen) und die Lebensfähigkeit des ruhenden Phasen, wodurch ein Vorfahre, Headtohead gegen seine eigenen Nachkommen zu konkurrieren oder “Evolution, die aus verschiedenen vergangenen beginnt wiedergeben”. Auferstehung Ökologie im Wesentlichen ermöglicht die Untersuchung, ob ein bestimmtes evolutionäres Ergebnis einige vorherige Ereignis abhängig ist. Die Identifizierung der genetischen Elemente der Evolution ist derzeit möglich in Laborversuchen mit Hilfe von Mikroorganismen für die “Erblinien” eingefroren und wieder zum Leben erweckt werden für eine vergleichende Analyse mit ihren weiterentwickelten Nachkomme6. Eine der wichtigsten Einschränkungen mit Labor Organismen zu arbeiten ist jedoch, dass “angestammten” einer bereits verschobene Basislinie ist. Das Studium der ruhenden Phase ermöglicht die Entnahme von Proben aus Zeit älter jedenfalls Stress (z.B., unberührten Umweltbedingungen) und evolutionäre Flugbahnen von ungestörte Umweltbedingungen in verschiedenen letzten Staaten zu messen bis zur Neuzeit. In den letzten Jahren hat die Untersuchung der DNA-Polymorphismus im auferstandenen oder noch ruhenden Zooplankton Stadien wichtige Einblicke in die vergangenen demographischen und adaptive Prozesse zur Verfügung gestellt, die das Erbgut der heutigen Bevölkerung14 beigetragen haben , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. mit der höheren Verfügbarkeit von Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien das Genom und Transkriptom des auferstandenen oder noch ruhenden Phasen sequenziert werden können und die Art und Anzahl der genetischen Veränderungen in sich entwickelnden Bevölkerungen über angesammelt die Zeit gemessen.

Die Auferstehung SOP hier vorgestellten hat wichtige Anwendungen im Bereich der Multi-Omics auf zwei Ebenen. Multi-Omics-Technologien können an auferstandenen Exemplare, erlaubt eine umfassende Analyse der molekularen Elemente beteiligt adaptive Antworten auf ökologische Selektionsdruck angewendet werden. Darüber hinaus können Omics-Technologien auf Decapsulated aber noch ruhenden Phasen angewendet werden. Bisher wurde die Anwendung von Hochdurchsatz-Sequenziertechnologien ruhen Etappen durch das Erfordernis einer großen Menge von input-Material begrenzt. Diese Einschränkungen werden aufgehoben37. Mit der Senkung Anforderungen für Vormaterial und Fortschritt in Nanofluidics, kompletten Genoms (WGS) ist nun möglich aus so wenig wie 1 ng oder ein paar Pg Material38zu starten. Die Nutzung des gesamten Genoms Verstärkung (WGA) und ganze Transkriptom Verstärkung (WTA) Techniken, so dass die Anreicherung von DNA und RNA von sehr geringen Mengen von Gewebe, hat Metagenomik39,40 und Medizin revolutioniert. Forschung,41. Diese Technologien für die Decapsulated ruhende Eiern ermöglichen die Überschreitung der Grenzen, die Lebensfähigkeit des ruhenden Phasen und die Untersuchung von längeren Zeiträumen (z.B. Jahrhunderte) zugeordnet.

Die Auferstehung der Wirbellosen Gemeinschaften produzieren ruhende Phasen ermöglicht die Ausrichtung der Gemeinschaft Geschichten mit bekannten Änderungen in den Naturlandschaften oder Veränderungen der Umwelt aus Analysen der Sedimente Orsoils2abgeleitet. Die Analyse der Gemeinschaft Veränderungen in Reaktion auf Veränderungen der Umwelt bietet uns die Möglichkeit zu quantifizieren Eco-evolutionäre Rückmeldungen42 , die erhebliche Auswirkungen auf Bevölkerung Beharrlichkeit43, trophische Interaktionen44 haben , Gemeinde Versammlung45und Veränderungen im Ökosystem Funktionen und Services46. Schließlich sind genaue Vorhersagen über biologische Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt ausschlaggebend für den Schutz der Biodiversität47führen. Aktuelle prädiktiver Modelle sind in dieser Hinsicht ungenau, weil sie nicht ins Konto wichtige biologische Mechanismen wie Demografie, Zerstreuung, Evolution und Arten Interaktionen nehmen. Verstehen, wie diese Prozesse im Laufe der Zeit ändern und diese Informationen als eine vorherige Prognose Modellierung werden unsere Fähigkeit, Arten Vorhersagen verbessern und Persistenz der Gemeinschaft angesichts der ökologischen ändern2.

Die Anwendung der hier vorgestellten SOP ist nicht ohne Herausforderungen. Die größte Einschränkung der Wiederbelebung ruhender Stadien ist die Notwendigkeit von Spezialausrüstungen für die Probenahme. Darüber hinaus erfordert der gesamte Prozess von Sediment Siebung, Einrichtung von klonalen Kulturen erheblichen Arbeitsaufwand beträgt.

Einige der hier vorgestellten SOP-Schritte sind leicht übertragbar auf andere Daphnien -Arten. Diese sind: Probenahme, Einrichtung von klonalen Linien und experimentelles Design. Weitere Schritte der SOP können jedoch weitere Optimierung zugeschnitten auf die untersuchten Arten erforderlich. Delamination wird oft D. Magna Exemplare Schlupferfolg zu verbessern. Jedoch kann dieser Ansatz nicht für kleinere Exemplare geeignet. Schraffur Reize kann auch unter Art48 und unter Sicht Probe49variieren. Daher kann eine ad-hoc- Optimierung der Schraffur Schritte der SOP vor Anwendungen auf andere Krustentiere erforderlich sein. Während der Schlupferfolg der D. Magna Bevölkerung auferstanden aus See Ring (30,5 % über den sedimentären Archiv) im Einklang mit früheren Ergebnissen49ist, variiert je nach Schlupf Erfolg der Erhaltungszustand des Sediments, Gattung 50,51, und die geografische Herkunft der Sediment-48. Zukünftige Studien über die Mechanismen, die Einreise und das Fortschreiten durch die Phasen der Diapause regulieren ist erforderlich, um optimale Schlupf Reize zugeschnitten auf verschiedene Arten zu identifizieren.

Zu guter Letzt Hintergrundwissen für das Studiensystem, insbesondere die Arten von Interesse im Laufe der Zeit ratsam. Dies kann über historische Aufzeichnungen erreicht werden. Wenn historische Aufzeichnungen nicht verfügbar sind, empfiehlt Probenahme- und screening von Oberflächenschichten des Sediments See vor der Probennahme Kern, obwohl es nur über die jüngste Geschichte informieren kann.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die NERC Highlights Grant (NE/N016777/1) unterstützt. Ensis Ltd, wissenschaftliche Umweltdienstleistungen, Environmental Change Research Centre, University College London abgetastet und die Sedimentkern datiert.

Materials

sampling bags Fisher Scientific 11542783 Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand
piston corer ENSIS ltd na Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC
precision scale  Veritas-M124A TLP-50 Analytical Balance
geological sieve UKGE limited SV7521 200 mm diameter geological sieve – 1 mm mesh
geological sieve UKGE limited SV7525 200 mm diameter geological sieve – 0.125 mm mesh
white sampling tray nhbs http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 Standard mulipurpose lab trays 
pasteur pipette Globe Scientific inc. 138020B Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw – 0.9mL
stereo microscope nikon  smz800 Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit
petri dish EduLab 153-533 Sterile 90mm diameter plastic petri dish
glass jars  compak Round Jam Jars 4oz 100 mL jars 
glass jars  compak Atum Jars/ Bonta Jar 10oz 200 mL jars
glass jars  bottlecompanysouth 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid 500 mL jars 
statistical software R https://cran.r-project.org/ na Free online GNU  language and environment for statistical computing and graphics
microdissection forceps Fisher Scientific 41122405 Fine point stainless steel forceps for microdissections
image software https://imagej.nih.gov/ij/index.html na Open source ImageJ image processing toolkit  written in Java
mesocosm amazon na Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter
mirocentrifuge tubes  Sigma_Aldrick – Merck Z606340 premium microcentrifuge tubes 1.5 mL
AGENCOURT DNAdvance   Beckman Coulter A48705 DNA extraction kit
size standard Thermo Fisher Scientific 4322682 LIZ500 – Size standard compatible with ABI sequencers
ABI3032 sequencer ABI na Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing
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Cuenca Cambronero, M., Orsini, L. Resurrection of Dormant Daphnia magna: Protocol and Applications. J. Vis. Exp. (131), e56637, doi:10.3791/56637 (2018).
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