Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

Chronischer Lebererkrankung stellt eine große gesundheitliche Belastung weltweit¹. Tierforschung Modelle sind wichtige Werkzeuge in der Studie von Lebererkrankungen und haben dazu beigetragen, die Leberregeneration, hepatischen Entzündung sowie Steatose und Leberkrebs²komplexe Fragen. Eine beträchtliche Anzahl von diesen Tiermodellen verlassen sich auf die gentechnische Veränderung von Leberzellen. Deshalb sind effiziente Werkzeuge zur Genexpression in Hepatozyten manipulieren hilfreich³. Bewährte Methoden wie die Zucht von gentechnisch veränderte Mausstämme oder die Erzeugung von viralen Vektoren für Hepatozyten Infektion sind entweder zeitaufwendig, Hafen Sicherheitsbedenken oder liefern schlechte Transgene Ausdruck in Hepatozyten in vivo ^{4 , 5}. hydrodynamischen Schweif Vene Injektion (HTVI) ist eine alternative Methode zur in Vivo Transfektion von Hepatozyten ermöglicht einfach, schnell und kostengünstig Verhör der Genfunktion in der Leber. Für HTVI ist ein Vektor mit der gewünschten DNA-Sequenz in einem Volumen von Kochsalzlösung entspricht 10 % des Körpergewichts des injizierten Tieres aufgelöst. Die Lösung wird dann in die Rute Vene innerhalb von 5-10 s⁶injiziert. Herzzeitvolumen überschreiten, fließt die Kochsalzlösung aus der minderwertigen Vena Cava in die Leber Venen, führt zur Erweiterung der Leber und hydrodynamischen Transfektion von Hepatozyten⁷. Um stabile genomischen Integration zu erreichen, wurde die Methode mit Transposon-basierte Vektoren, wie die Schönheit –Transposon Schlafsystem kombiniert. Diese Systeme vermittelt die Rekombination von Ziel Vektoren mit genomischen Rekombination katalysiert durch ein schlafen Schönheit –Transposase^8,9. Für Modelle der Leberfibrose oder Karzinogenese ist es oft wünschenswert, Overexpress oder Stille Gene zu bestimmten Zeitpunkten das Krankheitsmodell. Zu diesem Zweck Werkzeuge für induzierbaren Genexpression wie das Cre/LoxP-System oder Tetracyclin-induzierbaren gen Expressionssystems (Tet-On) können gebrauchte¹⁰sein.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für in Vivo Transfektion von murinen Hepatozyten mit HTVI ein Dornröschen Transposon-basiertes System. Zusätzlich ein Protokoll für stabil, konstitutive Expression des Transgens unter der Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotors, beschreiben wir eine erweiterte Vektorsystem, das konstitutive Tamoxifen-abhängige Cre-Rekombinase (CreER) Ausdruck mit vereint die induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MicroRNA angepasst ShRNA (MiR-ShRNA), genannt der pTC TET-System¹¹. In dieses Vektorsystem werden induzierbaren transgene oder MiR-ShRNAs für Tetracyclin-abhängigen Ausdruck in den Backbone-Vektor mit einem recombinational Klonen-System ermöglicht die schnelle und einfache Generation neuen Vektoren¹²geklont. In diesem Video-basierte Führer werden Zubereitung von geeigneten Vektoren, Injektion und Behandlung von Mäusen, induzierbaren Transgen/MiR-ShRNA Ausdruck zu erreichen, und schließlich die Vorbereitung des Lebergewebes für die Analyse. In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Kombination eines Cre/LoxP vermittelte Maus Systems mit dem Ausdruck oder Knock-down-Wahl, so dass es ein allgemein einsetzbares System in der Forschung von Lebererkrankungen-gen zu aktivieren.