JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Методология для индукции мокроты и лаборатория обработки

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/56612
, , , , , , , ,
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group,University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines),University of Liege

Summary

Здесь мы описываем метод индукции мокроты. Этот протокол также объясняет обработки для выполнения счетчик дифференциального клеток и для сбора мокроты супернатанта мокроты и клетки для дальнейшего анализа.

Abstract

Техника мокроты индукции и обработки является признанным неинвазивный метод, позволяющий сбора и анализа клеток от airways, которая интересна в различных респираторных заболеваний, как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), хронический кашель, или идиопатического легочного фиброза. Эта техника хорошо переносится, безопасный и неинвазивный, но в настоящее время ограничивается исследовательских услуг и специализированных центров в клинической практике, потому что это технически сложной, трудоемкой и требует квалифицированного персонала. Успех мокроты индукции и анализа составляет около 80%.

Здесь мы описываем индукции и лаборатория обработки образцов мокроты. Мокрота индуцируется ингаляции гипертонических или изотонического раствора с сальбутамол. Для обработки, мы используем технику весь мокроты. Дитиотреитол (DTT) используется для разрешения mucolysis мокроты. Основная цель обработки мокроты является подсчитывать дифференциального клеток для изучения типов клеток, в просвете дыхательных путей. Может также дополнительные анализы мокроты супернатанта и мокроты клетки, которые могут позволить дальнейшее расследование воспалительные процессы и иммунные механизмы. Примеры включают изучение посредников в мокроте супернатанта и выполнение большой спектр анализа мокроты клетки, такие как проточной цитометрии, геномики и протеомики.

Наконец представитель результаты анализа мокроты в здорового управления, астматиков и больных ХОБЛ представлены.

Introduction

Несколько методов используются для изучения воспаления дыхательных путей: прямые измерения (как бронхиальная биопсии или бронхоальвеолярного смывов) и косвенных методов (как симптом оценки, кровь образцов тестов функции анализа и легких)1. Прямые методы имеют преимущество надежно оценки воспаления дыхательных путей, но они являются инвазивными и не осуществимо при больших масштабах из-за пациента дискомфорт и риск понесенных1. Что касается косвенных методов они плохо коррелирует с прямой оценкой воспаление дыхательных путей1.

Сбор мокроты является еще одним способом образец клеток из дыхательных путей и позволяет прямой оценки воспаления дыхательных путей. Тем не менее производство мокроты спонтанно может привести примеры низкого качества и не возможно для всех пациентов2. Этот вопрос был преодолен с помощью ультразвука аэрозоле гипертонических солевых чтобы побудить мокроты производства2. Этот метод был первоначально используется у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) для диагностики Pneumocystis carinii пневмонии3 и был адаптирован для здоровых испытуемых и астматиков в 1992 году4. Мокрота индукции также возможно в более тяжелых больных с помощью изотонический солевой5. Хотя обычно хорошо переносится, вдыхание физиологического раствора может вызвать бронхоспазма у больных с hyperresponsive airways5. Поэтому рекомендуется осуществлять агонист короткого действия бета-версии перед процедура1. Кроме того нам показали ранее, что добавление сальбутамол физраствора в ультразвуковой ингалятор далее снизился этот риск6. Преимущества индукции мокроты, что это неинвазивный2 и5принимаются безопасной, когда соответствующие меры предосторожности.

Для обработки образцов мокроты, в настоящее время используется два метода в литературе: техника вся мокроты и вилка выбор7. В нашей лаборатории выполняется метод весь мокроты. Основная цель обработки мокроты является подсчитывать дифференциального клеток для изучения типа воспаления в просвете дыхательных путей. Однако, многие дополнительные анализы также возможность дальнейшего расследования воспалительные процессы и иммунные механизмы, изучая посредников в мокроте супернатанта8 либо выполнив детальное расследование на клетки мокроты (например , цитометрии9, культуры клеток10, геномики10, протеомики10, immunocytochemistry7, в situ гибридизация7, и т.д.потока)

Техника мокроты индукции и анализа в настоящее время ограничивается исследовательских услуг и специализированных центров в клинической практике потому, что она является технически сложной, трудоемкой и требует квалифицированного персонала1. С помощью этого метода для различных респираторных заболеваний, как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), хронический кашель или идиопатический фиброз легких11могут расследоваться воспаления дыхательных путей.

Protocol

Все методы, описанные в этом разделе были утверждены Комитетом по этике больницы Университета Льеж и всех здоровых испытуемых дал письменное информированное согласие на участие. 1. мокроты индукции До и после бронхолитическое спирометрия Выполните Спирометрия (объем форсированного выдоха за 1 секунду [ОФВ1] и принудительного жизненной емкости [ФЖЕЛ] маневр) согласно американской грудной общества (САР) / Европейского общества дыхания (ERS) стандартные критерии12. Администрируйте 400 мкг ингаляции сальбутамола от дозированных ингаляторов (MDI) через устройство прокладку.Примечание: В взрослых, неблагоприятные события ингаляции сальбутамола включают тремор и тахикардия13. Повторите Спирометрия (ОФВ1 и маневр ФЖЕЛ) 15 минут позже, согласно САР/ERS стандартные критерии12. Подготовка Ультразвуковой ингаляторПримечание: Ингалятор должны быть тщательно очищены и продезинфицированы перед каждым использованием, в соответствии с инструкциями производителя. Заполните ингалятор камеры с дистиллированной водой до рекомендованного уровня. Место чистой Кубок в камере ингалятора. Обложка Кубок с соответствующим крышкой. Заполните чашку с либо 50 мл гипертонический солевой раствор (5%) для пациента с после бронхолитическое ОФВ1 > 65% предсказать или 50 мл изотонический солевой раствор (0,9%) для пациента с после бронхолитическое ОФВ1≤65% предсказать. Добавьте 1,75 мл сальбутамола сульфат раствора (5 мг/мл) в чашке. Соедините трубы и клапаны в соответствии с инструкциями производителя. Коллекция распыления и мокротыПримечание: Выполните технику под медицинским наблюдением. Объясните процедуру для пациента. Попросите пациента использовать носовой зажим. Включите распылитель и выберите самый низкий уровень параметров аэрозоля и вентилятор. Попросите пациента вдыхают аэрозолей через рот кусок с приливными дыхание на 5 мин.Примечание: Параметры аэрозольной и вентилятор может быть увеличен в зависимости от пациента терпимости. В случае невыносимой кашель или тошнота прекратите процедуру и перейдите к шагу 1.3.5. В случае стеснение в груди или респираторных дискомфорт перейдите к шагу 1.3.8. Выключите прибор. Попросите пациента, чтобы удалить клип нос, прополоскать рот водой и полоскать дважды, прежде чем выбросить его в раковину.Примечание: Слюна клетки могут загрязнить образец мокроты и привести к непригодным для использования образца. Попросите пациента кашель мокрота в пластиковый контейнер. Выполните Спирометрия (принудительный экспираторного маневра) для измерения ОФВ1. Оценить падение ОФВ1 следующим образом: (ОФВ1 измеряется на шаге 3.8 [мл]) – (после бронхолитическое ОФВ1 измеряется в шаге 1.3 [мл]) / (после бронхолитическое ОФВ1 измеряется в шаге 1.3 [мл]) * 100. Если ОФВ1 падает на 20% или более от значения после бронхолитическое, прекратите процедуру. Мера ОФВ1 раз в 10 минут позже. Если ОФВ1 приходится 20% или более, попросите врача для администрирования аэрозоле ипратропия бромид (0.25 мг/2 мл) и держать пациента под медицинским наблюдением. Перейдите к шагу 1.3.10. Если ОФВ1 не упасть на 20% или более от значения после бронхолитическое, повторите шаги с 3,2 до 3,9 один-три раза для достижения полной распылительной время 10-20 мин.Примечание: Время общая распыления будет зависеть качество (наличие вилки или вязкой частей) и количество образцов мокроты. Если образец качества и/или количество бедных после распыления в 10 минут, процедура должна быть расширена достичь полной распылительной время 15-20 мин. Храните в холодильнике до обработки образца мокроты. 2. мокроты обработка Примечание: Процесс мокроты в течение 3 часов для жизнеспособности оптимальное ячейки выборки. Предупреждение: Носите пальто лаборатории, защитные перчатки и очки. Предварительная подготовка Сделайте десятикратного разбавления концентрированных Дитиотреитол решения (муколитический агент) с стерильной дистиллированной водой до получения 10 мл раствора 6,5 мм, в соответствии с инструкциями производителя.Примечание: Во избежание раствор концентрированный Дитиотреитол смешивания с окружающим воздухом, отозвать решение из флакона с стерильный шприц и иглу. После открытия, флакон концентрированный раствор необходимо хранить при комнатной температуре и использовать в течение 5 дней. Разбавленный раствор готовится ежедневно.ВНИМАНИЕ: Ввиду опасности раздражение глаз и кожи, носите защитное оборудование (одежда, перчатки и защитные очки). Сделайте 5 раз разбавления раствора Трипановый синий (0,4%) с Дульбекко Phosphate-Buffered соли (DPBS) для получения 0,08% раствором. Держите этот промывочный раствор при комнатной температуре и использовать в течение 2 недель.ВНИМАНИЕ: Ввиду канцерогенной опасности, носите защитное оборудование (одежда, перчатки и защитные очки). Сбор мокроты супернатант Передача всей мокроты в 50 мл коническое дно пластиковую трубку и взвесить образец. Добавьте 3 раза вес DPBS раствора. Медленно вихревой образца для 30 s. Центрифуга на 800 x g и 4 ° C на 10 мин. Фильтр образец через 2 одиночные слои стерильную марлю и собирать супернатант в 50 мл коническое дно пластиковую трубку. Аликвота супернатант в 2 мл пластиковых труб и хранить их в-80 ° C.Примечание: Супернатанта образцы являются полезными для анализа мокроты жидкой фазы компонентов. Mucolysis мокроты При необходимости, добавьте DPBS Пелле ячейки для достижения общего объема суспензию клеток по 5 мл. Разбавления суспензии клеток с 1 объем Дитиотреитол 6,5 мм. Используйте скамейке рокер рок суспензию клеток для 20 мин при комнатной температуре. Повторите по крайней мере 3 раза с DPBS. Центрифуга суспензию разреженных клеток на 550 x g и 4 ° C на 10 мин.Выбросите супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в примерно 1 мл DPBS. Оценка качественных свойств образца мокроты (концентрации клеток плоскоклеточный загрязнения и жизнеспособности методом исключения Трипановый синий) графом Горяева Оценить и запишите точный объем суспензии клеток. Добавьте 50 мкл суспензии клеток с 50 мкл раствора Трипановый синий 0,08% и гомогенизации. Поместить образец под coverslip Горяева (Thoma палата) и поместите его под оптический микроскоп (400 X). Граф плоскоклеточный клетки, не плоскоклеточный клетки живых (неокрашенный клетки) и мертвых плоскоклеточный клетки (синяя клетки).Примечание: В случае плотность ячеек слишком низким или слишком высоким, концентрата или разбавления суспензии клеток и повторите шаги 2.4.1-2.4.3. Оценка концентрации клеток подвеска, процент плоскоклеточный клеток и процент жизнеспособность не плоскоклеточный клеток.Примечание: Вычислить общее не плоскоклеточный фото/g мокроты: клетки концентрация взвеси (шаг 5.4) * объем суспензии клеток (шаг 4.8) * % не плоскоклеточный клеток / вес образца мокроты (шаг 2.2.1). Подготовка окрашенных cytospin слайд с суспензию клеток и хранения остаточного клеток, при необходимостиПримечание: Если суспензию клеток содержит более чем на 80% плоскоклеточный клетки, образец считается бедным качество и непригодна для cytospin слайд14. В этом случае прекратить обработку и рассмотрим этот пример неудачной. Разбавьте Алиготе суспензию клеток с DPBS для получения по крайней мере 350 мкл суспензии клеток на 500000 клеток/мл. Соберите концентратор ячейки в соответствии с инструкциями производителя. Заполните каждый из 3 отсеков ячейки концентратор с 100 мкл этой суспензии клеток. В cytocentrifuge спина на 2 мин 150 x g и комнатной температуре. Выбросите supernatants. Разбирайте концентратор ячейки в соответствии с инструкциями производителя. Разрешить на слайд, чтобы воздух сухой.Примечание: На данном этапе, остаточная клетки могут храниться в адекватных буфера при необходимости для дальнейших экспериментов. Пятно слайд с коммерческой пятнать комплекта (см. Таблицу материалов), в соответствии с инструкциями производителя. Смонтируйте слайд с подходящей монтажа средних и крышка выскальзования. Поместите слайд под оптический микроскоп (600 X) с маслом погружения. Рассчитывать по крайней мере 500 не плоскоклеточный клетки: нейтрофилов, эозинофилов, макрофагов, лимфоцитов и клеток эпителия.Примечание: Дифференциальные клеток обычно выполняется только один или два посвященных и подготовку наблюдателей ограничить interobserver расхождений. Абсолютные значения записей и доли каждого типа клеток.

Representative Results

ГоряеваТипичное изображение будет показано в Рисунок 1 , которая визуализируется с использованием Горяева микроскопа. Плоскоклеточный клетки легко определить, как они гораздо больше, чем не плоскоклеточный клетки. Эти клетки плоского эпителия, эпителиальные клетки приходя от устья. Оба типа клеток являются запятнана Трипановый синий, когда мертвые. Необходимо проявлять осторожность во избежание подсчета дрожжей, бактерий и металлолома. Рисунок 1 : Горяева рисунок (A) жизнь не-плоскоклеточный, (B) мертвый плоскоклеточный клеток и (C) плоскоклеточный клеток. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Cytospin слайд: на рисунке 2 показан образ представителя cytospin слайд, полученных после обработки мокроты. Различных типов клеток (нейтрофилов, эозинофилов, макрофагов, лимфоцитов и клеток эпителия) могут быть продифференцированы посредством их морфологии и окраской. В некоторых случаях загрязнение плоскоклеточный клетки могут быть важными и, если процент плоскоклеточный клеток больше, чем 80%, образец считается неудачным (рис. 3). Рисунок 2 : Cytospin слайд рисунок (A) нейтрофилов, (B) макрофагов, (C) eosinophil, (D) лимфоцитов и (E) эпителиальных клеток. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : Пример cytospin слайд низкого качества с > 80% плоскоклеточный клеток. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Показатель успехаВ нашем отделе успешность процедуры (сочетания успешных индукции и читается cytospin), основанные на выборке из 1129 больных (здоровых испытуемых, астматики или ХОБЛ), 82% (924/1129). В суб-анализ в зависимости от типа пациентов успех ставка составляет 75% (57/76) в здоровых испытуемых, 82% (827/1004) астматиков и 82% (40/49) у больных ХОБЛ. Результаты в здоровых испытуемыхРетроспективный анализ ряда 289 здоровых испытуемых из нашего отдела, медиана (межквартильный диапазон) мокроты вес был 3.72 g (межквартильный диапазон 2.46 g – 5.54 g) и средний всего не-плоскоклеточный фото/g мокроты был 0.59 x6 (10) межквартильный диапазон 0,37 x 106 – 1,29 х 106). В этих здоровых испытуемых низка доля плоскоклеточный клеток на 19% (10% – 34) и жизнеспособность на 66% (54-78%). Что касается доли различных типов клеток результаты резюмируются в рисунке 4A. Мы можем наблюдать, что процент макрофагов (49% [31-68%]) является выше, чем процент нейтрофилов (34% [14% – 60%]), а процент лимфоцитов (2% [1-3]), эозинофилов (0% [0% – 0%]) и эпителиальных клеток (4% [2-11%]) является низким. Эти результаты схожи, когда данные выражены в абсолютных величинах (рис. 4В). Рисунок 4 : Представитель результаты подсчета дифференциальной клеток наблюдается в здоровых испытуемых выражены в процентах (A) или (B) абсолютные значения. Результаты представлены как медиана (межквартильный диапазон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Важно также учитывать возраст больных. Действительно сильная корреляция между возраст пациента и доля нейтрофилов в присутствует мокроты (рис. 5). Аналогичным образом при классификации больных по 10 лет возрастных групп (рис. 6), мы наблюдали значительное увеличение числа нейтрофилов с увеличением возраста. Таким образом эта переменная должна рассматриваться при сравнении результатов от различных когорт, и осторожность должны быть приняты в соответствующих субъектов. Рисунок 5: Корреляция между возрастом и мокроты нейтрофилов процент. Была рассчитана корреляции Спирмена тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6: Эволюция нейтрофилов процент согласно возрастная категория. P значение ANOVA был < 0.0001 для сравнения нейтрофилов процент между возрастных классов. Множественные сравнения были сделаны с Данн множественные сравнения теста. P значения представлены следующим образом: * p < 0,05, ** p < 0.01, и *** p < 0,001. Результаты представлены как медиана (межквартильный диапазон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Результаты у пациентов, страдающих от заболеваний органов дыханияМетод индуцированной мокроты обычно используется для оценки профиля воспалительных клеток у больных астмой.Этот метод может применяться также для пациентов, страдающих от ХОБЛ, другой воспалительных заболеваний дыхательных путей. При сравнении здоровых испытуемых, астматиков и больных ХОБЛ (3 группы, сопоставляемой по возрасту, полу и табака привычки), мы наблюдали, что профиль воспалительных клеток отличается между этими когорты (рис. 7). Действительно астматических больных обычно характеризуются поднял мокроте эозинофилов, в то время как доля мокроты нейтрофилы обычно выше у больных ХОБЛ, по сравнению с здорового управления, который связан с тяжести заболевания. Рисунок 7 : Мокроты воспалительных клеток профиль здоровых испытуемых (n = 45), астматическим пациентов (n = 108) и больных ХОБЛ (n = 54). Три группы были сопоставимы по полу, возрасту и табака привычки. P значения ANOVA были < 0,05, < 0,0001, и < 0.0001 для сравнения нейтрофилов, эозинофилов и макрофагов между группами, соответственно. Множественные сравнения были сделаны с Данн множественные сравнения теста. P значения представлены следующим образом: * p < 0,05 и *** p < 0,001. Результаты представлены как медиана (межквартильный диапазон). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Метод индуцированной мокроты является полезным инструментом для изучения отсеке сократимость миокарда. Существует несколько возможных применений этой техники. Во-первых это может повысить знания о механизмах, участвующих в различных респираторных заболеваний и иммунных клеток. Например эта техника позволила расследование воспаления дыхательных путей в большой когорты больных, и было показано, что около половины астматических больных характеризуется аномальной сократимость Эозинофильный воспаление15, 16 , 17, в то время как ХОБЛ обычно проявляют повышенный мокроты нейтрофилов рассчитывать18. Эта техника также способствовало лучше характеристика воспаления дыхательных путей у больных с идиопатическим легочного фиброза и посредникам доказательств, которые могут способствовать этой болезни19. Во-вторых метод индуцированной мокроты может быть полезным для прогнозирования реакции на лечение. Например для прогнозирования маркер кортикостероидов отзывчивость11,18было показано наличие ненормальных процент мокроте эозинофилов. Астмы и ХОБЛ пошив дозы кортикостероидов для нормализации процент мокроте эозинофилов была показана более эффективно в уменьшении количества обострений чем регулировка лечение согласно текущей клинической11 ,,2021. В-третьих анализ мокрот может помочь разработать целевой терапии. К примеру наличие чрезмерного количества мокроты нейтрофилов в ХОБЛ и некоторые астматических больных привело к развитию antineutrophilic лечения11. В-четвертых техника может играть роль в диагностике. Например для постановки диагноза не астматик Эозинофильный бронхит11необходимо наличие мокроты эозинофилия.

Помимо получения отсчет дифференциального клетки, техника стимулирования мокроты также позволяет производительность многих дополнительных анализов, изучая супернатанта мокроты или мокроты клетки. Примеры с мокроты супернатанта включают анализ посредников8,,1922 и оценка деятельности эозинофилов образца для эозинофилов22. От клеток мокроты РНК могут быть извлечены и используется для микроРНК или экспрессии генов анализирует19,23 . Мокрота клетки также могут быть проанализированы на поток цитометрии9,23 , которая позволяет, среди прочего, иммунофенотипирование и сортировка клеток. Кроме того клетки мокрота может быть культивировали10, и их производство посредник может быть измеренной в vitro24. Стоит отметить, что в этом случае, посредник содержимое отличается от того, что можно найти в мокроте супернатант. Действительно посредники в мокроте супернатанта может влиять выделениями из дыхательных путей-резидентов клеток и экссудацию плазмы, вопреки мокроты клетки культуры модель24. Наконец иммуноцитохимии и в situ гибридизация можно также выполнить с помощью мокроты клетки7.

Индуцированной мокроты техника имеет некоторые ограничения. Индукции должна выполняться под наблюдением врача. Важно также для оператора дать тщательной инструкции для пациентов. Другие ограничения включают сотрудничество и состояние здоровья больных, как необходимы дыхательные усилия. Относительно целесообразности этой техники в детей несколько исследований сообщили, что она была успешной и безопасной у детей старше 6 лет25. Данные на детей < 6 лет хватает25, но вполне вероятно, что мокрота индукции трудно выполнить в этих детей14. Техника в настоящее время ограничивается исследований услуг и специализированных центров, потому что это технически сложной, трудоемкой, и он требует квалифицированного персонала1. Другое ограничение состоит, что техника мокроты индукции и анализа не всегда успешно, означает, что для чтения cytospin всегда не получается26. Однако процент успеха обычно составляет около 80% в различных когорт больных4,26,27,,2829. Наконец необходимо проявлять осторожность при сравнении различных когорт больных относительно соответствия возраста, как это было показано влияние мокроты клеток фото30,31. Аналогичным образом другие параметры, такие как гендерный фактор и табак привычки должны совпадать, поскольку они также могут мешать мокроты клеток фото29,32. Когда пациент согласования не представляется возможным, другим способом с учетом возраста, пола или Курение является скорректировать статистический анализ этих характеристик.

По сравнению с другими методами, которые позволяют собирать клетки от airways, как биопсия и Бронхоальвеолярный смывов, метод индуцированной мокроты имеет преимущества простой, хорошо переносится, безопасной, воспроизводимость, экономически эффективных и неинвазивные. Эти преимущества позволяют метод индуцированной мокроты в больших масштабах, и неоднократно со временем и сделать его альтернатива выбора для выборки сократимость миокарда. Bronchosorption является другой метод, позволяющий коллекции слизистую жидкость для того чтобы оценить сократимость посредников33. Хотя этот метод (требующих бронхоскопии) является более активным, чем индуцированной мокроты, она имеет преимущества избежать любого загрязнения слюной и получения более высоких концентраций посредников чем в Бронхоальвеолярный лаваж33.

Важнейшие шаги требуют внимания в протоколе. Во-первых необходимо проявлять осторожность, относительно физиологическим концентрация и время индукции, потому что эти два параметра могут влиять на результаты и поэтому должны быть стандартизированной34,35. Во-вторых mucolysis с DTT является важным шагом обработки. По сравнению с PBS DTT было показано лучше разойтись мокроты клетки7, который улучшает качество слайд cytopsin и важно иметь воспроизводимый клеток фото2. Однако муколитическое агент может мешать измерения биохимических компонентов.Шипование эксперименты затем должно быть выполнено при измерении новых биохимических соединений36. Наконец еще один важный шаг процедуры является клетка, считая шаг, который должен выполняться квалифицированным техническим специалистом для обеспечения надежного и интерпретации результатов.

Альтернативный метод, с помощью вилки мокроты (липкая или плотной части), вместо того, чтобы весь мокроты, также описаны в литературе7. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. Техника вся мокроты позволяет более быстрого обработки7, но часто загрязнена слюной, который ослабляет образца и могут снизить качество cytospins2,7. С техникой выбор вилку уменьшается загрязнение слюной, это означает, что образцы зачастую лучшего качества для дозировки жидкой фазы посредников и cytospin слайды7. Обработка является однако больше7 и выбранной вилки не может быть представителем всей выборки37. Также стоит отметить, что не все образцы содержат пробки, которые могут ограничения. Оба метода проверяются и воспроизводимость, и в настоящее время нет никаких доказательств того, что дифференцированный клеток, полученные из обоих этих методов являются разные14,38.

В будущем индуцированной мокроты может использоваться как клинический инструмент для предоставления биомаркеров для расследования, диагностики и управления всех видов воспалительных заболеваний органов дыхания.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана университета госпиталь Льеж (Чу Льеж). Мы признаем «Мгновения производств» для видео производства. Мы также признаем Cedric Франсуа, пациент, который появился в фильме.

Materials

Spirometer – Spirobank MIR France
Salbutamol MDI – Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0135-913 See drug available in the country
Nebulizer UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA UltraNeb U3000
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids DeVilbiss Healthcare USA 100HD-647
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers DeVilbiss Healthcare USA 1001005879
One-way Valves Hudson RCI USA 41664
One-way Valves Hudson RCI USA 41665
Aerosol T-connector  Hudson RCI USA 41077
Ventilation circuit monobranch corrugated Int'Air Medical France TA30A
NaCl 5 %  / / Produced by our hospital pharmacy
Mini-Plasco NaCl 0.9% B.Braun Medical  Diegem Belgium
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0094-987 See drug available in the country
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent Boehringer Ingelheim Germany CNK: 1543-305 See drug available in the country
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline LONZA Belgium BE17512F
Sputolysin reagent Calbiochem 56000
Trypan blue 0.4% solution 100 mL LONZA Bio Whittaker Belgium 17-942E
Hemocytometer – Thoma chamber Labor Optik Lancing UK 1500000
Hemacolor Stainig set Merck Belgium 1116610001 Alternative product  : Diff Quik Staining Set
 Medion Diagnostic 
Mounting medium – Entellan Merck Belgium 107960
Statspin Cytofuge 12  Beckman Coulter Belgium X00-003066-001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
  2. Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
  3. Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
  4. Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
  5. Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
  6. Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
  7. Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
  8. Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
  9. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
  10. Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
  11. Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
  12. Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
  13. Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
  14. Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
  15. Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
  16. Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?. BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
  17. Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
  18. Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
  19. Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
  20. Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
  21. Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
  22. Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
  23. Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
  24. Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
  25. Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
  26. Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
  27. Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
  28. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
  29. Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
  30. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  31. Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
  32. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
  33. Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
  34. Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
  35. Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
  36. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  37. Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).

Tags

Sputum InductionInduced SputumAirway DiseasePulmonary FibrosisNon-invasiveSpirometryBronchodilatorsHypertonic SalineIsotonic SalineSalbutamolNebulizerMedical SupervisionTidal Breathing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., Paulus, V., Graff, S., Schleich, F., Corhay, J., Louis, R., Moermans, C. Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing. J. Vis. Exp. (130), e56612, doi:10.3791/56612 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image