Aqui descrevemos a técnica de indução de escarro. Este protocolo também explica o escarro de processamento para realizar uma contagem diferencial de células e para coletar escarro sobrenadante e as células para uma análise mais aprofundada.
A técnica de indução de escarro e processamento é um método não-invasivo reconhecido, permitindo a coleta e a análise das células das vias aéreas, o que é interessante em várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou fibrose pulmonar idiopática. Esta técnica é bem tolerado, seguro e não invasivo, mas está atualmente limitada a serviços de pesquisa e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado. A taxa de sucesso de indução de escarro e análise é cerca de 80%.
Aqui, descrevemos a indução e laboratório de processamento de amostras de escarro. Expectoração é induzida por inalação de solução salina hipertônica ou isotônica com salbutamol. Para o processamento, nós usamos a técnica de escarro de todo. Ditiotreitol (DTT) é usado para permitir que o mucolysis de amostras de escarro. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar os tipos de células presentes no lúmen das vias aéreas. Análises adicionais podem ser efectuadas na expectoração sobrenadante e as células do escarro, que podem permitir a investigação sobre processos inflamatórios e mecanismos imunes. Exemplos incluem estudando mediadores na expectoração sobrenadante e realizando um amplo espectro de análise em células de escarro como citometria de fluxo, genômica ou proteômica.
Finalmente, apresentam-se resultados representativos de análise do escarro em doentes com DPOC, asmáticos e controles saudáveis.
Vários métodos são usados para investigar a inflamação das vias aéreas: direto de medições (como biópsias brônquicas ou lavado broncoalveolar lavages) e métodos indirectos (como sintoma, avaliação, testes de função de análise e pulmão de amostra de sangue)1. As técnicas diretas têm a vantagem de avaliar confiantemente a inflamação das vias aéreas, mas são invasiva e não viável em grande escala por causa do desconforto do paciente e o risco incorrido1. Quanto os métodos indirectos, eles mal se correlacionar com a avaliação direta da inflamação de vias aéreas1.
Coleta de escarro é outra maneira de amostras de células das vias aéreas e permite a avaliação direta da inflamação das vias aéreas. No entanto, produzir expectoração espontânea pode levar a amostras de má qualidade e não é possível para todos os pacientes2. Esta questão foi superada com o uso de nebulização ultra-sônica solução salina hipertônica para induzir a produção de expectoração2. Esse método foi inicialmente usado em pacientes infectados com o vírus de imunodeficiência humana (HIV) para o diagnóstico de pneumonia por Pneumocystis carinii pneumonia3 e foi adaptado para indivíduos saudáveis e asmáticos em 19924. Indução de escarro também é viável em pacientes mais graves com o uso de solução salina isotônica5. Embora geralmente bem tolerado, a inalação de solução salina pode causar broncoespasmo em pacientes com hyperresponsive vias aéreas5. Portanto, é aconselhável administrar um agonista beta de ação curta antes do procedimento1. Além disso, mostramos anteriormente que adicionar salbutamol para a solução salina no nebulizador ultra-sônico diminuiu ainda mais este risco6. As vantagens da indução de escarro é que é não-invasivo2 e seguro quando apropriado precauções5.
Para o processamento de amostras de escarro, dois métodos são atualmente usados na literatura: a técnica de escarro toda e a ficha de seleção7. Em nosso laboratório, é realizada a técnica de escarro de todo. O objetivo principal do processamento de escarro é obter uma contagem diferencial de células para estudar o tipo de inflamação presente no lúmen das vias aéreas. No entanto, muitas análises adicionais também são possíveis investigar processos inflamatórios e mecanismos imunes, estudando mediadores no escarro sobrenadante8 ou por meio de investigação detalhada em células de escarro (por exemplo, , fluxo cytometry9, culturas de células10, genómica10, proteomics10, imunocitoquímica7, in situ da hibridação7, etc)
A técnica de indução de escarro e análise está atualmente limitada a Pesquisar serviços e centros especializados na prática clínica porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado1. Inflamação das vias respiratórias pode ser investigada com este método para várias doenças respiratórias como a asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), tosse crônica ou de fibrose pulmonar idiopática11.
O método de escarro induzido é uma ferramenta útil para estudar o compartimento das vias respiratórias. Há várias possíveis aplicações desta técnica. Primeiro, pode melhorar o conhecimento sobre as células imunes e mecanismos envolvidos em diversas doenças respiratórias. Por exemplo, essa técnica tem permitido a investigação da inflamação das vias respiratórias em grandes coortes de pacientes, e tem sido demonstrado que cerca de metade dos pacientes asmáticos são caracterizados por um anormal das vias de inflamação eosinofílica15, 16 , 17, enquanto doentes com DPOC geralmente exibem um neutrófilo escarro levantadas contar18. Esta técnica também tem contribuído para melhor caracterização da inflamação das vias aéreas em pacientes com fibrose pulmonar idiopática e mediadores de evidências que podem contribuir para esta doença19. Em segundo lugar, a técnica de escarro induzido pode ser útil para predizer a resposta ao tratamento. Por exemplo, a presença de uma porcentagem anormal de eosinófilos escarro tem demonstrada ser um marcador preditivo de corticosteroide responsividade11,18. Em asma e DPOC, adequar a dose de corticosteroides para normalizar a percentagem de eosinófilos do escarro foi mostrado para ser mais eficaz na diminuição do número de exacerbações que o ajuste do tratamento de acordo com as actuais directrizes clínicas11 ,20,21. Em terceiro lugar, a análise do escarro pode ajudar a desenvolver terapias alvo. Por exemplo, a presença de um número anormal de neutrófilos de escarro na DPOC e alguns pacientes asmáticos tem levado ao desenvolvimento de tratamentos antineutrophilic11. Em quarto lugar, a técnica pode desempenhar um papel no diagnóstico. Por exemplo, a presença de eosinofilia de escarro é necessária fazer um diagnóstico de bronquite eosinofílica não asmática11.
Além de obter uma contagem diferencial de células, a técnica de indução de escarro também permite que o desempenho de muitas análises adicionais, ao estudar células de expectoração ou escarro sobrenadante. A análise dos mediadores8,19,22 e a avaliação da atividade quimiotáctica da amostra para eosinófilos22são exemplos com expectoração sobrenadante. De células do escarro, RNA pode ser extraído e usado para microRNA ou expressão gênica analisa19,23 . As células do escarro também podem ser analisadas pelo fluxo cytometry9,23 , que permite, entre outros, immunophenotyping e classificação de células. Além disso, escarro células podem ser cultivadas10, e sua produção do mediador pode ser medida na vitro24. É interessante notar que, neste caso, o conteúdo do mediador é diferente do que pode ser encontrado na expectoração sobrenadante. Com efeito, mediadores na expectoração sobrenadante podem ser influenciados por secreções de células residentes das vias aéreas e por exsudação de plasma, contrariando o escarro cultura celular modelo24. Finalmente, imunocitoquímica e em situ hibridação também pode ser executada usando o escarro células7.
A escarro induzido a técnica tem algumas limitações. A indução deve ser realizada sob supervisão médica. Também é essencial para o operador dar instruções completa aos pacientes. Outras limitações incluem a cooperação e a condição médica dos pacientes, que são necessários esforços respiratórios. Sobre a viabilidade desta técnica em crianças, vários estudos têm relatado que foi bem sucedida e segura em crianças com mais de 6 anos de idade25. Dados sobre crianças de < 6 anos de idade estão faltando25, mas é provável que a indução de escarro é difícil de executar essas crianças14. A técnica é atualmente restrita aos serviços e centros especializados de investigação porque é tecnicamente exigente, demorada e requer pessoal treinado1. Outra limitação é que a técnica de indução de escarro e análise não é sempre bem sucedida, significando que um cytospin legível não é sempre obtido26. No entanto, a taxa de sucesso é geralmente cerca de 80% em diferentes coortes de pacientes4,26,,27,28,29. Finalmente, o cuidado deve ser tomado quando comparando diferentes coortes de pacientes em relação a correspondência da idade, como foi mostrado para o impacto do escarro célula contagem30,31. Da mesma forma, outros parâmetros como sexo e tabaco hábitos tem que ser correspondido como eles também podem interferir com o escarro célula contagem29,32. Quando o paciente correspondência não é possível, outra maneira de considerar idade, sexo ou status de fumar é para ajustar a análise estatística para estas características.
Em comparação com outras técnicas que permitem a coleta de células de vias aéreas, como biópsias e lavado broncoalveolar lavages, o método de escarro induzido tem as vantagens de ser simples, bem tolerado, seguro, reprodutível, cost-effective e não-invasiva. Estas vantagens permitem que a técnica de escarro induzido a ser executada em grande escala e repetidamente ao longo do tempo e torná-lo uma alternativa de escolha para a amostragem das vias respiratórias. Bronchosorption é outra técnica que permite a coleta do fluido mucosa para avaliar as vias aéreas mediadores33. Enquanto esta técnica (exigindo broncoscopia) é mais invasiva do que o escarro induzido, tem as vantagens de evitar qualquer contaminação com saliva e obtenção de altas concentrações de mediadores do que na de lavagem broncoalveolar33.
Passos críticos precisam de atenção no protocolo. Primeiro, cuidado deve ser tomado sobre a concentração salina e o tempo de indução, porque esses dois parâmetros podem influenciar os resultados e, portanto, precisa ser padronizada34,35. Em segundo lugar, o mucolysis com TDT é uma etapa importante do tratamento. Em comparação com PBS, TDT foi mostrado para melhor dispersar escarro células7, que melhora a qualidade de slide cytopsin e é essencial ter uma célula pode ser reproduzido de contagem2. No entanto, o agente mucolítico pode interferir com a medição dos componentes bioquímicos.Cravação de experiências então deve ser realizado quando um novo composto bioquímico36de medição. Finalmente, uma outra etapa crítica do processo é a célula contando passo, que deve ser realizado por um técnico treinado para garantir resultados confiáveis e interpretáveis.
Um método alternativo usando fichas de escarro (peças de lêmures ou mais densas), em vez de escarro todo, também é descrito na literatura7. Ambas as técnicas têm vantagens e desvantagens. A escarro toda técnica permite mais rápido processamento7, mas é frequentemente contaminada com saliva, o que dilui a amostra e pode reduzir a qualidade do cytospins2,7. Com a técnica de seleção de plug, a contaminação da saliva é reduzida, o que significa que as amostras são muitas vezes de melhor qualidade para a dosagem dos mediadores da fase fluida e cytospin slides7. O processamento é no entanto mais7 e plugues selecionadas podem não ser representativa da amostra inteira37. É também interessante notar que nem todas as amostras contêm plugues, que podem ser um fator limitante. Ambos os métodos são validados e podem ser reproduzidos, e atualmente não há nenhuma evidência de que a contagem de células diferenciais obtidas de ambos esses métodos é diferentes de14,38.
No futuro, escarro induzido pode ser usado como uma ferramenta clínica para fornecer biomarcadores para a investigação, diagnóstico e gerenciamento de todos os tipos de doenças respiratórias inflamatórias.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Hospital da Universidade de Liège (Liège CHU). Reconhecemos “Produções de instantes” para a produção de vídeo. Também reconhecemos o Cedric François, o paciente que apareceu no filme.
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