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Medicine

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

Published: December 17, 2017
doi:
10.3791/56612
, , , , , , , ,
1Department of Respiratory Medicine, CHU Liege, GIGA I3 Research Group,University of Liege, 2Department of Clinical Pharmacy, CIRM (Center for Interdisciplinary Research on Medicines),University of Liege

Summary

Hier beschreiben wir die Technik der Auswurf Induktion. Dieses Protokoll erklärt auch das Sputum Verarbeitung auszuführenden differenzielle Zellzahl und Auswurf überstand zu sammeln und Zellen zur weiteren Analyse.

Abstract

Die Technik der Auswurf Induktion und Verarbeitung ist eine anerkannte nicht-invasive Methode ermöglicht die Erfassung und Analyse von Zellen aus den Atemwegen in interessante verschiedene Erkrankungen der Atemwege wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), chronischer Husten oder idiopathischer Lungenfibrose. Diese Technik ist gut verträglich, sicher und nicht-invasive, aber beschränkt sich derzeit auf Forschungsservice und spezialisierten Zentren in der klinischen Praxis weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal erfordert. Die Erfolgsquote der Auswurf Induktion und Analyse ist etwa 80 %.

Hier beschreiben wir die Induktion und Labor Verarbeitung von Sputum Proben. Auswurf wird durch das Einatmen von hypertonen oder isotonische Kochsalzlösung mit Salbutamol induziert. Für die Verarbeitung verwenden wir die ganze Sputum-Technik. Dithiothreitol (DTT) wird verwendet, um Mucolysis von Sputum Proben zu ermöglichen. Das primäre Ziel der Auswurf-Verarbeitung ist eine differenzielle Zellzahl zur Untersuchung in das Lumen der Atemwege vorhanden Zelltypen zu erhalten. Zusätzliche Analysen können auch durchgeführt werden, auf Sputum überstand und Auswurf-Zellen, die weitere Untersuchung entzündliche Prozesse und Abwehrmechanismen ermöglichen können. Beispiele hierfür sind Mediatoren im Sputum überstand zu studieren und ein breites Spektrum von Analysen auf der Auswurf Zellen wie Durchflusszytometrie, Genomik und Proteomik.

Schließlich werden repräsentative Ergebnisse der Auswurf Analyse in gesunden Kontrollpersonen, Asthmatiker und COPD-Patienten dargestellt.

Introduction

Verschiedene Methoden werden verwendet, um Entzündungen der Atemwege zu untersuchen: direkte Messungen (wie bronchiale Biopsien oder alvéolaire Lavages) und indirekte Methoden (wie Symptom Bewertung, Bluttests Probe Analyse und Lunge Funktion)1. Die direkte Techniken haben den Vorteil, zuverlässig beurteilen die Entzündung der Atemwege, aber sie sind invasive und nicht machbar im großen Maßstab wegen Patienten Beschwerden und das Risiko entstehen1. Wie bei der indirekten Methoden korrelieren sie schlecht mit der direkten Beurteilung der Atemwege Entzündung1.

Sputumansammlung ist eine weitere Möglichkeit, Sample-Zellen der Atemwege und ermöglicht die direkte Beurteilung der Entzündung der Atemwege. Dennoch produzieren Sputum spontan zu Proben von schlechter Qualität führen kann und ist nicht für alle Patienten2möglich. Dieses Problem konnte gelöst werden, mithilfe von Ultraschall vernebelt hypertonen Kochsalzlösung Sputum Produktion2induzieren. Diese Methode diente zunächst zur Diagnose von Pneumocystis-Carinii -Pneumonie-3 bei Patienten mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert und wurde für gesunden Probanden und Asthmatiker in 19924angepasst. Sputum Induktion kann auch bei schweren Patienten mit isotonischer Kochsalzlösung5. Obwohl in der Regel gut vertragen, kann die Inhalation von Kochsalzlösung Bronchospasmus bei Patienten mit hyperreaktiven Airways5führen. Daher wird es empfohlen, einen kurzwirksamen Beta-Agonisten vor dem Verfahren1. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt, dass die Salzlösung in der Ultraschallvernebler Salbutamol hinzufügen weiter dieses Risiko6 verringert. Die Vorteile der Auswurf Induktion ist, dass es nicht-invasive2 und sichere, wenn die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden5.

Für die Verarbeitung von Sputum Proben, werden derzeit zwei Methoden in der Literatur verwendet: die ganze Sputum-Technik und die Stecker Auswahl7. In unserem Labor erfolgt die gesamte Sputum-Technik. Das primäre Ziel der Auswurf-Verarbeitung ist eine differenzielle Zellzahl um die Art der Entzündung in das Lumen der Atemwege vorhanden Studie zu erhalten. Viele weitere Analysen sind jedoch auch möglich, weitere entzündliche Prozesse und Abwehrmechanismen, durch das Studium der Mediatoren im Sputum überstand8 oder indem die Detailuntersuchung auf Auswurf Zellen untersuchen (z.B. , flow Cytometry9, Zelle Kulturen10, Genomics10, Proteomics10, Immunocytochemistry7, in Situ Hybridisierung7, etc.)

Die Technik der Auswurf Induktion und Analyse beschränkt sich derzeit auf Dienstleistungen und spezialisierten Zentren in der klinischen Praxis zu erforschen, weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal1 erfordert. Entzündungen der Atemwege kann mit dieser Methode für verschiedene Erkrankungen der Atemwege wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), chronischer Husten oder idiopathischer Lungenfibrose11untersucht werden.

Protocol

Alle in diesem Abschnitt beschriebene Methoden wurden von der Ethikkommission der Universität Krankenhaus Lüttich genehmigt worden und alle gesunde Probanden gab schriftliche Einwilligungserklärung zur Teilnahme. 1. Sputum Induktion Pre- und Post-Bronchodilatator Spirometrie Führen Sie eine Spirometrie (exspiratorischen Volumen in 1 Sekunde [FEV1] gezwungen und forcierte Vitalkapazität [FVC] Manöver) nach der American Thoracic Society (ATS) / European Respiratory Society (ERS) Standardkriterien12. Verwalten Sie 400 µg von inhalativen Salbutamol von einem gemessenen Dosis Inhalator (MDI) durch ein Distanzstück Gerät.Hinweis: Bei Erwachsenen sind Nebenwirkungen von inhalativen Salbutamol Tremor und Tachykardie13. Wiederholen Sie Spirometrie (FEV1 und FVC-Manöver) 15 min später, nach der ATS/ERS Standardkriterien12. Vorbereitung der Ultraschall VerneblerHinweis: Der Vernebler muss gründlich gereinigt und desinfiziert werden vor jedem Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers. Füllen Sie die Verneblerkammer mit destilliertem Wasser bis zu den empfohlenen Wert. Stellen Sie eine saubere Tasse in der Verneblerkammer. Die Tasse mit dem entsprechenden Deckel abdecken. Füllen Sie die Tasse mit entweder 50 mL hypertonen Kochsalzlösung (5 %) für einen Patienten mit Post-Bronchodilatator FEV1 > 65 % vorhergesagt oder 50 mL isotonische Kochsalzlösung (0,9 %) für einen Patienten mit Post-Bronchodilatator FEV1≤65 % prognostiziert. Fügen Sie 1,75 mL Salbutamol Sulfat-Lösung (5 mg/mL) auf der Tasse. Schließen Sie die Rohre und Ventile gemäß den Anweisungen des Herstellers. Vernebelung und Auswurf SammlungHinweis: Führen Sie die Technik unter ärztlicher Aufsicht. Erklären Sie den Ablauf für den Patienten. Lassen Sie den Patienten eine Nasenklammer verwenden. Schalten Sie den Vernebler und wählen Sie die unterste Ebene der Aerosol und Lüfter-Einstellungen. Bitten Sie den Patienten, das Aerosol durch das Mundstück mit Gezeiten Atmung für 5 min zu inhalieren.Hinweis: Aerosol und Lüfter Einstellungen können je nach Toleranz des Patienten erhöht werden. Im Falle einer unerträglichen Husten oder Übelkeit das Verfahren einzustellen und gehen zu Schritt 1.3.5. Im Falle von Engegefühl in der Brust oder respiratorischen Beschwerden gehen Sie zu Schritt 1.3.8. Deaktivieren Sie den Vernebler. Lassen Sie den Patienten die Nasenklemme entfernen, spülen den Mund mit Wasser und Gurgeln zweimal, bevor Sie in die Spüle verwerfen.Hinweis: Speichel Zellen können Sputum Probe verunreinigen und führen zu einer unbrauchbaren Probe. Bitten Sie den Patienten zu Husten, Auswurf in einen Kunststoffbehälter. Führen Sie eine Spirometrie (erzwungene exspiratorischen Manöver) zur Messung der FEV1. Die FEV1 Fall wie folgt zu bewerten: (FEV1 gemessen bei Schritt 3,8 [mL]) – (Post-Bronchodilatator FEV1 gemessen am Schritt 1.3 [mL]) / (Post-Bronchodilatator FEV1 gemessen am Schritt 1.3 [mL]) * 100. Fällt die FEV1 um 20 % oder mehr von der Post-Bronchodilatator Wert, einzustellen Sie das Verfahren. FEV1 wieder 10 min. später zu messen. Fällt die FEV1 20 % oder mehr, Fragen Sie den Arzt zu verwalten vernebelt Ipratropium Bromid (0,25 mg/2 mL) und der Patient unter ärztlicher Aufsicht zu halten. Gehen Sie zu Schritt 1.3.10. Wenn die FEV1 nicht um 20 % oder mehr von der Post-Bronchodilatator Wert fällt, wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.9 ein-bis dreimal hintereinander insgesamt Vernebelung von 10 bis 20 min zu erreichen.Hinweis: Die gesamte Vernebelung Zeit Qualität (Vorhandensein von Steckern oder Viskose Teile) und der Auswurf Probenmenge hängt. Die Probenqualität und/oder Quantität ist schlecht nach 10 min der Vernebelung, sollte das Verfahren verlängert werden, um eine totale Vernebelung Zeit von 15 bis 20 min zu erreichen. Halten Sie die Auswurf-Probe gekühlt bis zur Verarbeitung. 2. Sputum Verarbeitung Hinweis: Bearbeiten der Auswurf innerhalb von 3 Stunden der Probenahme für optimale Zellviabilität. Achtung: Tragen Sie einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Schutzbrille. Erste Vorbereitungen Machen Sie eine 10-divisibel Verdünnung der Lösung konzentrierte Dithiothreitol (schleimlösende Agent) mit sterilem destilliertem Wasser 10 mL einer Lösung von 6,5 mM, gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erhalten.Hinweis: Zur Vermeidung von konzentrierten Dithiothreitol Lösung Vermischung mit Umgebungsluft zurückziehen der Lösung aus der Durchstechflasche mit eine sterile Spritze und Nadel. Nach dem Öffnen werden die Durchstechflasche konzentrierte Lösung bei Raumtemperatur aufbewahrt und innerhalb von 5 Tagen genutzt. Die verdünnte Lösung wird täglich frisch zubereitet.Achtung: Wegen Augen- und Hautreizungen Gefahr, tragen Sie Schutzausrüstung (Kleidung, Handschuhe und Schutzbrille). Machen Sie eine 5-fold Verdünnung der Lösung Trypan blau (0,4 %) mit Dulbeccos Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) eine 0,08 % ige Lösung zu erhalten. Diese verdünnte Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren und innerhalb von 2 Wochen.Achtung: Wegen der krebserzeugenden Gefahren tragen Sie Schutzausrüstung (Kleidung, Handschuhe und Schutzbrille). Sammlung von Sputum überstand Übertragen Sie ganze Sputum in ein 50 mL konischen Boden Kunststoffrohr und Wägen Sie die Probe. Fügen Sie ein 3-fold Gewicht des DPBS Lösung. Langsam Wirbel der Probe für 30 s. Zentrifuge bei 800 X g und 4 ° C für 10 Minuten. Filtern der Probe durch 2 Einzellagen steriler Gaze und den Überstand in ein 50 mL konischen Boden Kunststoffrohr zu sammeln. Aliquoten Überstand in 2 mL Kunststoff Rohre und bei-80 ° c aufbewahrenHinweis: Überstand Proben sind nützlich, um Sputum Fluiden Phase Komponenten bestimmen. Sputum Mucolysis Falls erforderlich, fügen Sie DPBS zum Zelle Pellet, ein Gesamtvolumen von 5 mL Zellsuspension zu erreichen. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit 1 Volumen von 6,5 mM Dithiothreitol. Verwenden Sie einen Bank-Rocker die Zellsuspension für 20 min bei Raumtemperatur zu rocken. Wiederholen Sie mindestens 3 Mal mit DPBS. Zentrifugieren Sie die verdünnter Zellsuspension bei 550 x g und 4 ° C für 10 min.Verwerfen Sie den überstand. Die Zelle-Pellets in etwa 1 mL des DPBS aufzuwirbeln. Bewertung der qualitativen Eigenschaften der Sputum Probe (Zellkonzentration, Plattenepithelkarzinom Kontamination und Lebensfähigkeit von Trypan blau-Ausschluss-Methode) von Hemocytometer Graf Bewerten Sie und notieren Sie die genaue Menge der Zellsuspension. 50 µL der Lösung 0,08 % Trypan blau 50 µL Zellsuspension hinzu und homogenisieren. Legen Sie die Probe unter dem Deckglas ein Hemocytometer (Thoma-Kammer) und legen Sie es unter dem Lichtmikroskop (400 X). Die Plattenepithelzellen, die lebenden nicht-Plattenepithelkarzinom Zellen (ungefärbt) und die Toten Plattenepithelkarzinom Zellen zählen (blau gefärbte Zellen).Hinweis: Bei zu niedriger oder zu hoher Zelldichte, konzentrieren Sie oder verdünnen Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie die Schritte 2.4.1-2.4.3. Beurteilen Sie die Zellkonzentration der Suspension, den Prozentsatz der Plattenepithelzellen und der Prozentsatz der Lebensfähigkeit der nicht-Plattenepithelien.Hinweis: Berechnen Sie die gesamten nicht-Plattenepithelkarzinom Graf/g Sputum: Handy-Konzentration der Suspension (Schritt 5.4) * Volumen der Zellsuspension (Schritt 4.8) * % der nicht-Plattenepithelien / Gewicht der Sputum Probe (Schritt 2.2.1). Vorbereitung der gefärbten Cytospin schieben mit der Zellsuspension und Speicherung der verbleibenden Zellen bei BedarfHinweis: Wenn die Zellsuspension enthält mehr als 80 % Plattenepithelkarzinom Zellen, die Probe gilt als Armen Qualität und ungeeignet für eine Cytospin Folie14. In diesem Fall die Verarbeitung unterbrechen und betrachten in diesem Beispiel nicht erfolgreich. Ein Aliquot der Zellsuspension mit DPBS mindestens 350 µL Zellsuspension bei 500.000 Zellen/mL zu verdünnen. Montieren Sie die Zelle Konzentrator gemäß den Anweisungen des Herstellers. Füllen Sie jede der 3 Fächer des Konzentrators Zelle mit 100 µL dieser Zellsuspension. In einem Cytocentrifuge spin für 2 min bei 150 x g und Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Überstände. Zerlegen des Zelle Konzentrators gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen.Hinweis: In diesem Stadium können verbleibende Zellen in einem ausreichenden Puffer gespeichert werden bei Bedarf für weitere Experimente. Fleck, die Folie mit einem kommerziellen Färbung kit (siehe die Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Montieren Sie die Folie mit einer geeigneten Eindeckmittel und einem Deckglas. Legen Sie die Folie unter dem Lichtmikroskop (600 X) mit Ölimmersion. Zählen Sie mindestens 500 nicht-Plattenepithelien: Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen.Hinweis: Differential Zellenzahl erfolgt in der Regel nur von einem oder zwei gewidmet und geschulte Beobachter, interobserver Diskrepanzen zu begrenzen. Rekord Absolute Werte und Prozentangaben der einzelnen Zelle.

Representative Results

HemocytometerEin typisches Bild ist in Abbildung 1 dargestellt, die mit dem Mikroskop mit Hilfe der Hemocytometer visualisiert wird. Plattenepithelien sind leicht erkennbar, da sie viel größer als die nicht-Plattenepithel-Zellen sind. Diese Plattenepithelzellen sind Epithelzellen aus dem Mund kommen. Beide Arten von Zellen werden durch Trypan blau, wenn tote gefärbt. Vorsicht muß genommen werden, zu zählen, Hefen, Bakterien und Schrott. Abbildung 1 : Hemocytometer Abbildung (A) ihren Lebensunterhalt nicht-Plattenepithelkarzinom, (B) einen Toten nicht-Plattenepithelkarzinom und (C) ein Plattenepithelkarzinom Zelle. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Cytospin Folie: Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Bild der Cytospin Folie nach Auswurf Verarbeitung erhalten. Die verschiedenen Zelltypen (Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Epithelzellen) können durch ihre Morphologie und Färbung unterschieden werden. In einigen Fällen Kontamination durch Plattenepithelien kann wichtig sein und wenn der Prozentsatz der Plattenepithelien größer als 80 % ist, gilt die Probe erfolglos (Abbildung 3). Abbildung 2 : Cytospin Folie Bild (A) eine Neutrophilen, (B) eine Makrophage, (C) eine Eosinophilen (D) eine Lymphozyten und (E) eine Epithelzelle. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Beispiel für eine schlechte Qualität Cytospin Folie mit > 80 % der Plattenepithelzellen. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. ErfolgsquoteIn unserer Abteilung die Erfolgsrate des Verfahrens (eine Kombination aus einer erfolgreichen Einarbeitung und eine lesbare Cytospin), basierend auf einer Stichprobe von 1.129 Patienten (gesunden Probanden, Asthma oder COPD-Patienten), 82 % (924/1.129). In einem Sub-Analyse nach der Art des Patienten ist die Erfolgsquote bei 75 % (57/76) bei gesunden Probanden, 82 % (827/1.004) bei Asthmatikern und 82 % (40/49) bei COPD-Patienten. Ergebnisse bei gesunden ProbandenIn einer retrospektiven Analyse einer Reihe von 289 gesunden Probanden aus unserer Abteilung, der Median (Interquartilbereich) Auswurf Gewicht war 3,72 g (Interquartilbereich 2,46 g – 5,54 g) und die mittlere total nicht-Plattenepithelkarzinom Graf/g Sputum 0,59 x6 (10) Interquartilbereich 0,37 x 106 – 1,29 x 106). Bei den gesunden Probanden der Anteil der Plattenepithelien ist gering und liegt bei 19 % (10 % bis 34 %) und die Lebensfähigkeit ist hoch bei 66 % (54-78 %). Bezüglich der Anteil der verschiedenen Zelltypen werden die Ergebnisse in Abbildung 4Azusammengefasst. Wir können beobachten, dass der Prozentsatz von Makrophagen (49 % [31-68 %]) ist höher als der Anteil der Neutrophilen (34 % [14 % – 60 %]), während der Anteil der Lymphozyten (2 % [1-3]), eosinophile (0 % [0-0 %]) und Epithelzellen (4 % [2-11 %]) sind niedrig. Diese Ergebnisse ähneln, wenn Daten in absoluten Werten (Abbildung 4 b) ausgedrückt werden. Abbildung 4 : Repräsentative Ergebnisse für die differenzielle Zellzahl bei gesunden Probanden, ausgedrückt als Prozentsätze (A) oder (B) Absolutwerte beobachtet. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Es ist auch wichtig, das Alter der Patienten zu berücksichtigen. In der Tat ist eine starke Korrelation zwischen Alter des Patienten und der Anteil der Neutrophilen im Sputum Proben (Abbildung 5). Ebenso, wenn Patienten nach 10-Jahres-Altersgruppen (Abbildung 6) klassifizieren, beobachteten wir eine deutliche Zunahme der Neutrophilen Anteil mit zunehmendem Alter. Daher diese Variable betrachtet werden, wenn Sie Ergebnisse aus verschiedenen Kohorten zu vergleichen, und Vorsicht getroffen werden, in die passenden Themen. Abbildung 5: Korrelation zwischen Alter und Auswurf Neutrophilenzahl Prozentsatz. Die Korrelation wurde berechnet mit der Spearman-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6: Evolution der Neutrophilen Anteil entsprechend der Lebensaltersstufe. Der p-Wert von ANOVA war < 0,0001 für den Vergleich der Neutrophilen Prozentsatz zwischen Altersklassen. Mehrere Vergleiche wurden mit Dunns multiple Vergleiche-Test gemacht. Die p-Werte sind wie folgt dargestellt: * p < 0,05, ** p < 0.01 und *** p < 0,001. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Ergebnisse bei Patienten mit Erkrankungen der AtemwegeDie Technik der induzierte Sputum wird häufig verwendet, das entzündliche Zelle Profil bei asthmatischen Patienten beurteilen.Diese Technik kann auch für Patienten mit COPD, einer anderen entzündlichen Erkrankung der Atemwege angewendet werden. Beim Vergleich von gesunden Probanden, Asthmatiker und COPD-Patienten (die 3 Gruppen für Alter, Geschlecht und Tabak Gewohnheiten verglichen wird), haben wir beobachtet, dass die entzündlichen Zelle Profil zwischen diese Kohorten (Abbildung 7 unterscheidet). In der Tat, Asthma-Patienten in der Regel erhöhte Sputum Eosinophile, zeichnen sich durch während der Anteil der Neutrophilen Auswurf bei COPD-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen in der Regel höher ist, ist mit der Schwere der Erkrankung verbunden. Abbildung 7 : Sputum entzündliche Zelle Profil von gesunden Probanden (n = 45), Asthma-Patienten (n = 108), und COPD-Patienten (n = 54). Die drei Gruppen wurden für Geschlecht, Alter und Tabak Gewohnheiten abgestimmt. Die p-Werte der ANOVA waren < 0,05, < 0,0001, und < 0,0001 für den Vergleich der Neutrophilen, eosinophilen Granulozyten und Makrophagen zwischen Gruppen, beziehungsweise. Mehrere Vergleiche wurden mit Dunns multiple Vergleiche-Test gemacht. Die p-Werte sind wie folgt dargestellt: * p < 0,05 und *** p < 0,001. Ergebnisse werden als Median (Interquartilbereich) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die induzierte Sputum-Methode ist ein nützliches Werkzeug, um die Atemwege Fach zu studieren. Es gibt mehrere mögliche Anwendungen dieser Technik. Erstens kann es wissen über Immunzellen und Mechanismen, die in verschiedenen Erkrankungen der Atemwege verbessern. Zum Beispiel dieser Technik hat die Untersuchung der Atemwege Entzündung im großen Kohorten von Patienten erlaubt, und es hat sich gezeigt, dass etwa die Hälfte der Asthma-Patienten durch eine abnorme Atemwege Eosinophile Entzündung15, gekennzeichnet sind 16 , 17, während COPD-Patienten weisen in der Regel eine erhöhte Sputum Neutrophilen zählen18. Diese Technik hat auch beigetragen, um bessere Charakterisierung der Entzündung der Atemwege bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose und Beweise Mediatoren, die zu dieser Krankheit19beitragen können. Zweitens kann die Technik induzierte Sputum vorherzusagen Reaktion auf die Behandlung hilfreich sein. Zum Beispiel das Vorhandensein einer abnormen Prozentsatz der Auswurf Eosinophile nachweislich eine prädiktive Marker Kortikosteroid Reaktionsfähigkeit11,18sein. Asthma und COPD zeigte Anpassung der Dosis von Kortikosteroiden, den Prozentsatz der Auswurf Eosinophile normalisieren sich mehr wirksam bei der Verringerung der Zahl der Exazerbationen als Anpassung der Behandlung nach den aktuellen klinischen Richtlinien11 ,20,21. Drittens kann Sputum Analyse helfen, um gezielte Therapien zu entwickeln. Zum Beispiel hat die Anwesenheit von eine abnorme Anzahl von neutrophilen Granulozyten Sputum in COPD und Asthma-Patienten zur Entwicklung der antineutrophilic Behandlungen11geführt. Viertens kann die Technik eine Rolle bei der Diagnose. Das Vorhandensein von Sputum Eosinophilie ist beispielsweise notwendig, um eine Diagnose von nicht-asthmatischen Eosinophile Bronchitis11.

Neben der Erlangung einer differenziellen Zellzahl, erlaubt die Technik der Induktion Auswurf auch die Durchführung von viele zusätzliche Analysen, durch das Studium entweder Sputum überstand oder Sputum Zellen. Beispiele mit Sputum überstand die Analyse der Mediatoren8,19,22 und die Bewertung der chemotaktische Aktivität der Probe für Eosinophile22. Aus Sputum Zellen RNA kann extrahiert und verwendet für MicroRNA oder Genexpression analysiert19,23 . Die Auswurf-Zellen können auch durch Flow Cytometry9,23 ermöglicht unter anderem die Immunphänotypisierung und Sortieren von Zellen analysiert werden. Darüber hinaus kann Sputum Zellen kultiviert10sein können, und ihre Vermittler-Produktion gemessene in-vitro-24. Es ist erwähnenswert, dass in diesem Fall, der Mediator Inhalt unterscheidet sich von was im Sputum überstand gefunden werden kann. In der Tat können Mediatoren im Sputum Überstand durch Sekrete aus den Atemwegen resident Zellen und Plasma Exsudation, im Gegensatz zu den Auswurf Zelle Kultur Modell24beeinflusst werden. Zu guter Letzt kann Immunocytochemistry und in Situ Hybridisierung auch mit Auswurf Zellen7durchgeführt werden.

Die induzierte Sputum-Technik hat einige Einschränkungen. Die Induktion muss unter ärztlicher Aufsicht durchgeführt werden. Es ist auch wichtig für den Betreiber, genaue Anweisungen für die Patienten zu geben. Andere Einschränkungen umfassen die Zusammenarbeit und den Gesundheitszustand des Patienten, wie respiratorische Anstrengungen erforderlich sind. Bezüglich der Machbarkeit dieser Technik bei Kindern haben mehrere Studien berichtet, dass es erfolgreich und sicher bei Kindern älter als 6 Jahre alt25war. Daten über Kinder der < 6. Lebensjahr fehlen25, aber es ist wahrscheinlich, dass Sputum Induktion schwierig in diesen Kindern14durchzuführen ist. Die Technik beschränkt sich derzeit auf Dienstleistungen und spezialisierten Zentren zu erforschen, weil es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig ist und geschultes Personal1 erfordert. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Technik der Auswurf Induktion und Analyse ist nicht immer erfolgreich, was bedeutet, dass eine lesbare Cytospin26nicht immer erreicht wird. Die Erfolgsquote ist jedoch in der Regel ca. 80 % in verschiedenen Kohorten von Patienten4,26,27,28,29. Zu guter Letzt muss Vorsicht beim Vergleich verschiedener Kohorten von Patienten über die passenden Alters, wie es gezeigt wurde, um die Auswirkungen der Auswurf Zelle zählen30,31. Ebenso haben andere Parameter wie Geschlecht und Tabak Gewohnheiten angepasst werden, da sie auch mit dem Sputum Zelle zählen29,32stören können. Wenn Patienten Abgleich nicht möglich ist, ist eine weitere Möglichkeit, Alter, Geschlecht oder Rauchen Status berücksichtigen die statistische Auswertung für diese Eigenschaften anzupassen.

Im Vergleich zu anderen Techniken, die es ermöglichen, sammeln von Zellen von Airways, wie Biopsien und alvéolaire Lavages hat induzierte Sputum-Methode die Vorteile des Seins einfach, gut verträglich, sicher, reproduzierbar, kostengünstig und nicht-invasive. Diese Vorteile ermöglichen die induzierte Sputum-Technik in großem Maßstab und wiederholt im Laufe der Zeit durchgeführt werden, und machen es zu einer Alternative der Wahl für die Atemwege Probenahme. Bronchosorption ist eine andere Technik ermöglicht die Sammlung der Schleimhaut Flüssigkeit um Atemwege Mediatoren33zu bewerten. Während diese Technik (die Bronchoskopie) mehr invasiv als induzierte Sputum ist, hat es die Vorteile der Vermeidung von Verunreinigungen mit Speichel und höhere Konzentrationen von Mediatoren als alvéolaire Lavage33erhalten.

Wichtige Schritte brauchen Aufmerksamkeit im Protokoll. Erstens muss Vorsicht über die saline Konzentration und die Zeit der Induktion, weil diese beiden Parameter können Einfluss auf die Ergebnisse und daher standardisierte34,35 müssen. Zweitens ist die Mucolysis mit DVB-t-ein wichtiger Schritt der Verarbeitung. Im Vergleich zu PBS zeigte sich DVB-t besser Sputum Zellen7, zu zerstreuen, die verbessert die Cytopsin Folie und ist sehr wichtig, eine reproduzierbare Zelle zählen2. Jedoch kann die schleimlösende Agent mit der Messung von biochemischen Komponenten stören.Spick Experimente sollten dann durchgeführt werden, wenn eine neue biochemische Verbindung36messen. Schließlich ist ein weiterer wichtiger Schritt des Verfahrens der Zelle zählen Schritt, die von einem geschulten Techniker, zuverlässig und interpretierbare Ergebnisse gewährleisten durchgeführt werden müssen.

Eine alternative Methode mit Auswurf Stecker (zähflüssig oder dichteren Teile), statt die ganze Sputum wird auch in der Literatur7beschrieben. Beide Verfahren haben vor- und Nachteile. Die ganze Sputum-Technik ermöglicht die schnellere Verarbeitung7, aber ist häufig kontaminiert mit Speichel, die die Probe verdünnt und kann die Qualität der Cytospins2,7reduzieren. Mit der Stecker-Auswahl-Technik wird die Speichel Kontamination reduziert, was bedeutet, dass Proben oft von besserer Qualität für die Dosierung von Fluiden Phase Mediatoren und Cytospin Folien7. Die Verarbeitung ist jedoch länger7 und ausgewählten Stecker möglicherweise nicht repräsentativ für die gesamte Probe-37. Es ist auch erwähnenswert, dass nicht alle Proben Stecker, enthalten, die begrenzt werden können. Beide Methoden sind validierte und reproduzierbare und derzeit gibt es keine Beweise, dass die differenzielle Zellenzahlen von beiden Methoden erhalten verschiedene14,38.

In Zukunft könnte induzierte Sputum als klinische Werkzeug Biomarker für die Untersuchung, Diagnose und Behandlung aller Arten von entzündlichen Erkrankungen der Atemwege zu verwendet werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Universität Lüttich Krankenhaus (CHU Lüttich) unterstützt. Wir anerkennen “Instants Produktionen” für die Videoproduktion. Wir anerkennen auch Cedric François, der Patient, der im Film erschien.

Materials

Spirometer – Spirobank MIR France
Salbutamol MDI – Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0135-913 See drug available in the country
Nebulizer UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA UltraNeb U3000
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids DeVilbiss Healthcare USA 100HD-647
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers DeVilbiss Healthcare USA 1001005879
One-way Valves Hudson RCI USA 41664
One-way Valves Hudson RCI USA 41665
Aerosol T-connector  Hudson RCI USA 41077
Ventilation circuit monobranch corrugated Int'Air Medical France TA30A
NaCl 5 %  / / Produced by our hospital pharmacy
Mini-Plasco NaCl 0.9% B.Braun Medical  Diegem Belgium
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin GLAXOSMITHKLINE CNK: 0094-987 See drug available in the country
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent Boehringer Ingelheim Germany CNK: 1543-305 See drug available in the country
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline LONZA Belgium BE17512F
Sputolysin reagent Calbiochem 56000
Trypan blue 0.4% solution 100 mL LONZA Bio Whittaker Belgium 17-942E
Hemocytometer – Thoma chamber Labor Optik Lancing UK 1500000
Hemacolor Stainig set Merck Belgium 1116610001 Alternative product  : Diff Quik Staining Set
 Medion Diagnostic 
Mounting medium – Entellan Merck Belgium 107960
Statspin Cytofuge 12  Beckman Coulter Belgium X00-003066-001
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References

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Guiot, J., Demarche, S., Henket, M., Paulus, V., Graff, S., Schleich, F., Corhay, J., Louis, R., Moermans, C. Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing. J. Vis. Exp. (130), e56612, doi:10.3791/56612 (2017).
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