منهجية الاستقراء البصاق وتجهيز المختبرات
Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب الاستقراء البصاق. ويشرح هذا البروتوكول أيضا البصاق التجهيز لأداء عدد خلايا المتمايزة وجمع البصاق طافية وخلايا لمزيد من التحليل.
Abstract
أسلوب الاستقراء البصاق والتجهيز وهو أسلوب غير الغازية المعترف بها مما يسمح جمع وتحليل الخلايا من الخطوط الجوية، ومثيرة للاهتمام في مختلف أمراض الجهاز التنفسي مثل الربو ومرض انسداد الشعب الهوائية المزمن (COPD)، السعال المزمن أو التليف الرئوي مجهول السبب. هذا الأسلوب هو جيد التحمل وآمنة وغير الغازية، ولكن يقتصر حاليا على خدمات البحوث والمراكز المتخصصة في الممارسة السريرية لأنها صعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب موظفين مدربين. معدل نجاح البصاق الاستقراء والتحليل هو حوالي 80%.
هنا، نحن تصف تجهيز عينات البصاق التعريفي والمختبرات. البلغم هو الناجم عن استنشاق المحلول الملحي مكثف أو متساوي التوتر مع السالبوتامول. للتجهيز، نستخدم تقنية البصاق كله. يتم استخدام ديثيوثريتول (DTT) للسماح موكوليسيس لعينات البصاق. والهدف الرئيسي لمعالجة البلغم الحصول على عدد خلايا المتمايزة لدراسة أنواع الخلايا الموجودة في التجويف مجرى الهواء. يمكن أيضا إجراء تحاليل إضافية على البصاق طافية والخلايا البصاق، والتي قد تسمح لمزيد التحقيق في العمليات التحريضية والآليات المناعية. ومن الأمثلة دراسة الوسطاء في البصاق طافية وتنفيذ طائفة واسعة من التحليل على خلايا البصاق مثل التدفق الخلوي أو علم الجينوم، البروتيوميات.
وأخيراً، تعرض الممثل نتائج تحليل البصاق في ضوابط صحية، والربو، ومرضى هذا المرض.
Introduction
يتم استخدام عدة أساليب للتحقيق التهاب مجرى الهواء: المباشر القياسات (مثل الشعب الهوائية خزعات أو لافاجيس للفيسيولوجيا) والطرق غير المباشرة (مثل تقييم الأعراض، واختبارات وظائف الرئة وتحليل عينة الدم)1. التقنيات المباشرة لها ميزة تقييم موثوق بها التهاب مجرى الهواء، بل مقياس طليقا الغازية وغير مجدية بسبب إزعاج المريض والخطر تكبد1. أما بالنسبة للأساليب غير المباشرة، أنها سيئة ترتبط بالتقييم المباشر ل التهاب مجرى الهواء1.
جمع البصاق هو طريقة أخرى للخلايا عينة من الخطوط الجوية، وتسمح التقييم المباشر لالتهاب مجرى الهواء. ومع ذلك، تنتج البصاق عفويا قد يؤدي إلى عينات نوعية رديئة وليس من الممكن لجميع المرضى2. تم التغلب على هذه المشكلة باستخدام المياه المالحة مكثف يتم المرذوذ للحث على إنتاج البلغم2. هذا الأسلوب كان يستخدم في البداية في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) لتشخيص المتكيسه الجؤجؤية الالتهاب الرئوي3 وتم تكييفها للأصحاء والمصابين بالربو في 19924. التعريفي البصاق ممكناً أيضا في المرضى أشد باستخدام المالحة متساوي التوتر5. على الرغم من أن عادة جيد التحمل، قد يسبب استنشاق المحلول الملحي bronchospasm في المرضى الذين يعانون من الخطوط الجوية هايبرريسبونسيفي5. ولذلك، من المستحسن لإدارة مؤثر بيتا قصير قبل الإجراء1. وعلاوة على ذلك، وقد أظهرنا سابقا أن إضافة السالبوتامول للمحلول الملحي في البخاخات بالموجات فوق الصوتية كذلك انخفض هذا الخطر6. مزايا التعريفي البصاق هو أنه من غير الغازية2 ويتم اتخاذ احتياطات الأمن عند الاقتضاء5.
لتجهيز عينات البصاق، حاليا تستخدم طريقتين في الأدب: تقنية البصاق كله و اختيار التوصيل7. في المختبر، يتم تنفيذ هذا الأسلوب البلغم كله. والهدف الرئيسي لمعالجة البلغم الحصول على عدد خلايا المتمايزة لدراسة نوع التهاب في التجويف مجرى الهواء. بيد أن تحليلات إضافية كثيرة أيضا ممكنة لمواصلة التحقيق العمليات التحريضية والآليات المناعية، أما عن طريق دراسة الوسطاء في البصاق طاف8 أو بإجراء تحقيق مفصل في خلايا البصاق (مثلاً ، التدفق الخلوي9، خلية الثقافات10، علم الجينوم10، البروتيوميات10، إيمونوسيتوتشيميستري7، في الموقع التهجين7، إلخ)
أسلوب الاستقراء البصاق والتحليل ومحدودة في الوقت الراهن البحث الخدمات والمراكز المتخصصة في الممارسة السريرية لأنها صعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب تدريب الموظفين1. قد حققت التهاب مجرى الهواء باستخدام هذا الأسلوب لمختلف أمراض الجهاز التنفسي مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) والسعال المزمن أو التليف الرئوي مجهول السبب11.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب البصاق المستحث أداة مفيدة لدراسة حجرة مجرى الهواء. وهناك العديد من التطبيقات الممكنة لهذا الأسلوب. أولاً، أنه يمكن تحسين المعرفة بالخلايا المناعية والآليات التي تشارك في مختلف أمراض الجهاز التنفسي. على سبيل المثال، هذا الأسلوب قد سمح التحقيق في التهاب مجرى الهواء في أفواج كبيرة من المرضى، وقد ثبت أن حوالي نصف مرضى الربو تتميز بعامل مجرى الهواء غير طبيعي التهاب اليوزيني15، 16 , عد 17، بينما مرضى هذا المرض عادة ما يحمل العَدلات آثار بصاق18. كما أسهم هذا الأسلوب لوصف أفضل لالتهاب مجرى الهواء في المرضى الذين يعانون من تليف رئوي مجهول السبب والوسطاء الأدلة التي قد تسهم في هذا المرض19. ثانيا، قد يكون من المفيد للتنبؤ باستجابة للعلاج تقنية البصاق المستحث. على سبيل المثال، أظهرت وجود نسبة غير طبيعية من الحمضات البلغم لتكون علامة تنبؤية القشرية استجابة11،18. في الربو وهذا المرض، وأبدى الخياطة جرعة الكورتيكوستيرويدات لتطبيع نسبة الحمضات البلغم لتكون أكثر فعالية في خفض عدد التفاقم من ضبط العلاج وفقا للمبادئ التوجيهية السريرية الحالية11 ،،من2021. ثالثا، قد يساعد تحليل البصاق لتطوير العلاجات المستهدفة. على سبيل المثال، وجود عدد غير طبيعي من العَدلات البلغم في بعض مرضى الربو وهذا المرض قد أدى إلى تطوير علاجات أنتينيوتروفيليك11. ورابعاً، التقنية قد تلعب دوراً في التشخيص. على سبيل المثال، وجود فرط البصاق ضروري لإجراء تشخيص غير الربو التهاب الشعب الهوائية اليوزيني11.
بالإضافة إلى الحصول على عدد خلايا المتمايزة، يسمح أسلوب يحفز البلغم أيضا أداء تحليلات إضافية عديدة، بدراسة الخلايا البلغم أو البصاق طافية. الأمثلة مع البصاق طاف تحليل الوسطاء8،،من1922 وتقييم نشاط العينة الحمضات22تشيموتاكتيك. من خلايا البصاق، يمكن استخراج الحمض النووي الريبي وتستخدم ميكرورنا أو تحليل التعبير الجيني19،23 . يمكن أيضا أن تحلل خلايا البصاق بالتدفق الخلوي9،23 الذي يسمح، من بين أمور أخرى، إيمونوفينوتيبينج، وفرز الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون خلايا البصاق مثقف10، وإنتاجها وسيط يمكن قياسها في المختبر24. تجدر الإشارة إلى أنه في هذه الحالة، ومحتوى الوسيط يختلف عن ما يمكن العثور في البصاق طافية. في الواقع، قد تتأثر الوسطاء في البصاق طافية إفرازات من خلايا المقيم مجرى الهواء ونتحه البلازما، خلافا لنموذج الثقافة الخلية البصاق24. وأخيراً، التهجين إيمونوسيتوتشيميستري و في الموقع يمكن أيضا إجراء باستخدام خلايا البصاق7.
تقنية البصاق المستحث ببعض القيود. يجب أن يتم تدريب تحت إشراف طبي. من الضروري أيضا للمشغل لإعطاء إرشادات دقيقة للمرضى. وتشمل القيود الأخرى التعاون والحالة الطبية للمرضى، كما أن هناك حاجة إلى جهود الجهاز التنفسي. فيما يتعلق بجدوى هذا الأسلوب في الأطفال، وقد أفادت العديد من الدراسات أنه ناجحة وآمنة في الأطفال تزيد أعمارهم عن 6 سنوات من العمر25. البيانات المتعلقة بالأطفال من < 6 سنوات عمر ولا توجد25، ولكن من المحتمل أن الاستقراء البصاق من الصعب على أداء هؤلاء الأطفال14. الأسلوب مقيد حاليا لإجراء بحوث الخدمات والمراكز المتخصصة لأنها صعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب تدريب الموظفين1. قيد آخر أن أسلوب البصاق الاستقراء والتحليل وليست دائماً ناجحة، بمعنى أن سيتوسبين لقراءة لم يتم دائماً الحصول على26. بيد أن معدل النجاح هو عادة حوالي 80% في مجموعات مختلفة من المرضى4،،من2627،،من2829. وأخيراً، يجب توخي الحذر عند مقارنة مجموعات مختلفة من المرضى فيما يتعلق بمطابقة للسن كما هو مبين للتأثير على البصاق خلية العد30،31. وبالمثل، معلمات أخرى مثل نوع الجنس والتبغ العادات يجب أن تكون مطابقة لأنها قد تتداخل أيضا مع البصاق خلية العد29،32. عند مطابقة المريض غير ممكن، طريقة أخرى لمراعاة السن أو الجنس أو حالة التدخين لضبط التحليل الإحصائي لهذه الخصائص.
مقارنة بغيرها من التقنيات التي تسمح لجمع الخلايا من الخطوط الجوية، مثل الخزعات ولافاجيس للفيسيولوجيا، قد الأسلوب البصاق المستحث مزايا بسيطة وجيد التحمل وآمنة، واستنساخه، فعالة من حيث التكلفة وغير الغازية. هذه المزايا تسمح تقنية البصاق المستحث المراد تنفيذها على نطاق واسع، ومرارا وتكرارا على مر الزمن، وجعلها بديلاً خيار لأخذ العينات الهوائية. برونتشوسوربتيون أسلوب آخر، مما يتيح جمع السائل البطانة المخاطية بغية تقييم مجرى الهواء الوسطاء33. أن هذا الأسلوب (التي تتطلب القصبات) الغازية أكثر من البصاق المستحث، فإنها المزايا لتجنب أي تلوث باللعاب والحصول على تركيزات أعلى من الوسطاء من الغسل للفيسيولوجيا33.
الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى عناية في البروتوكول. أولاً، يجب توخي الحذر بشأن تركيز الملوحة ووقت التعريفي، ونظرا لأن هذين المعيارين يمكن أن تؤثر على النتائج ولذلك يجب أن تكون موحدة34،35. ثانيا، موكوليسيس مع DTT خطوة هامة للتجهيز. وأبدى DTT مقارنة ببرنامج تلفزيوني، لتفريق البصاق الخلايا7، مما يحسن نوعية الشريحة سيتوبسين ومن الضروري أن يكون عد استنساخه من خلية2أفضل. ومع ذلك، عامل mucolytic قد تتداخل مع قياس المكونات البيوكيميائية.النتوءات تجارب ينبغي ثم إجراء عند قياس مجمع الكيمياء الحيوية جديدة36. وأخيراً، هو خطوة حاسمة أخرى من الإجراءات خلية العد الخطوة التي يجب إجراؤها بواسطة أحد الفنيين مدربين ضمان الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها والتفسير.
كما يتم وصف أسلوب بديل باستخدام سدادات البصاق (أجزاء فيسسيد أو أكثر كثافة)، بدلاً من البلغم كله، في الأدب7. كلا التقنيات لديها مزايا وعيوب. تقنية البلغم كله يسمح أكثر سرعة تجهيز7، ولكن كثيرا ما ملوثة باللعاب، مما يخفف العينة، ويمكن أن يقلل من جودة سيتوسبينس2،7. مع تقنية اختيار التوصيل، يتم تقليل تلوث اللعاب، مما يعني أن العينات غالباً ما تكون ذات نوعية أفضل لجرعة الوسطاء مرحلة السائل و الشرائح سيتوسبين7. التجهيز أطول ولكن7 والمقابس المحددة قد لا تكون ممثلة ل العينة كلها37. كما تجدر الإشارة إلى أن ليس جميع العينات تحتوي على المقابس، الذي يمكن أن يكون مقيداً. كلا الأسلوبين تم التحقق من صحتها واستنساخه، ولا يوجد حاليا لا دليل على أن التهم الخلية المتمايزة التي تم الحصول عليها من كل من هذه الأساليب هي مختلفة14،38.
وفي المستقبل، يمكن استخدام البصاق المستحث كأداة سريرية لتوفير المؤشرات الحيوية للتحقيق، والتشخيص، وإدارة جميع أنواع أمراض التهابات الجهاز التنفسي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “مستشفى جامعة لييج” (CHU لياج). ونعترف للإنتاج “إينستانتس” لإنتاج الفيديو. ونعترف أيضا سيدريك فرانسوا، المريض الذي ظهر في الفيلم.
Materials
| Spirometer – Spirobank | MIR France | ||
| Salbutamol MDI – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
| Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
| Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
| DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
| One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
| Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
| Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
| NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
| Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
| Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
| Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
| Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
| Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
| Hemocytometer – Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
| Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
| Mounting medium – Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
| Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |
References
- Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).
- Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. The use of induced sputum to investigate airway inflammation. Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).
- Leigh, T. R., et al. Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).
- Pin, I., et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).
- Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. Safety of sputum induction. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).
- Delvaux, M., et al. Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma. Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).
- Efthimiadis, A., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).
- Kelly, M., et al. Analysis of fluid-phase mediators. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Vignola, A. M., et al. Future directions. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).
- Brightling, C. E. Clinical applications of induced sputum. Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).
- Miller, M. R. Standardisation of spirometry. European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).
- Szefler, S. J., et al. Asthma outcomes: biomarkers. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).
- Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms. Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).
- Schleich, F. N., et al. Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma. The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).
- Demarche, S., et al. Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?. BMC pulmonary medicine. 16, 46 (2016).
- Pavord, I. D., et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s (2002).
- Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7. PLOS ONE. 12 (2), e0171344 (2017).
- Green, R. H., et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).
- Siva, R., et al. Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial. European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).
- Louis, R., et al. Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).
- Maes, T., et al. Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).
- Moermans, C., et al. Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease. Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).
- Gibson, P. G., et al. Sputum induction in children. European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).
- Reddel, H. K., et al. An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).
- Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity. The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).
- Demarche, S. F., et al. Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).
- Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).
- Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing. Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).
- Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
- Chalmers, G. W., et al. Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma. Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).
- Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).
- Popov, T. A., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis). European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).
- Holz, O., et al. Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days. Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).
- Louis, R., et al. The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum. European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).
- Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects. American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
- Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination. The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).
