Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

Es bien sabido que las proteínas celulares someterse a rotación extensa, con tasas de síntesis y degradación es específica para cada proteína y conforme a la regulación fisiológica. Tradicionalmente, las tasas de degradación de proteína han sido medidos utilizando métodos a granel, tales como el análisis de chase de pulso radiactivo, ni recurrir a inhibidores de la síntesis de proteínas como la cicloheximida¹. Más recientemente, Isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (SILAC) en combinación con la espectrometría de masas se ha establecido para cuantificar el volumen de la proteína en una escala global². Sin embargo, estos métodos están limitados por un promedio de población, y por lo tanto se pierde la información sobre la variabilidad de célula a célula. Además, no se puede identificar cambios transitorios en la degradación de las proteínas que son sincronización entre la población de la célula.

Como alternativa, proteínas de vida media también puede ser determinado por los enfoques basados en la fluorescencia, que a menudo tienen la ventaja de proporcionar resolución unicelular. Por ejemplo, una proteína fluorescente verde photoactivatable (paGFP) se ha utilizado para determinar Oct4 Half-Life en el mamífero embrión temprano³. Otro método para controlar la descomposición de proteína en las células vivas es el uso de una etiqueta de cierre en combinación con imágenes de Time-lapse de fluorescencia. La etiqueta de cierre es una versión mutante de la DNA reparación enzimática O⁶– alkylguanine ADN-Alquilotransferasa (AGT) que reacciona específicamente con benzylguanine derivados (BG), que se pueden acoplar a sondas moleculares^{4,5, 6}. por lo tanto, cualquier proteína de la fusión de SNAP tag puede etiquetarse irreversible con un colorante fluorescente, de permeable de la célula. Pulso de etiquetado de una proteína de interés unida a la etiqueta de complemento, seguida de lavado del tinte residual, permite monitoreo de la degradación de la población de proteínas marcadas y así para determinar la vida media de la proteína. Etiquetas de cierre se han utilizado con éxito para el pulso-persiga el etiquetado de proteínas y para la determinación de proteína vida media en adherente celular cultivo e in vivo^5,7,8,9. Una gran variedad de sustratos de SNAP tag cubriendo comúnmente utilizado los espectros fluorescentes están disponibles en el mercado, lo que permite la selección del colorante óptimo para cada aplicación específica. Por lo tanto, también pueden utilizarse SNAP-etiquetas para imágenes multicolor en combinación con otras proteínas de fusión fluorescentes o colorantes. Tintes de celda impermeable son adecuados para el etiquetado de las proteínas de membrana atada, mientras que tintes permeable a la célula son aplicables para el control de proteínas intracelulares y de membrana-limitan. Además, algunas de estas puntas de prueba no exhiben casi ninguna fluorescencia basal y sólo empezar a emitir una fuerte señal fluorescente sobre Unión SNAP tag¹⁰.

Este protocolo describe cómo medir las tasas de degradación de diversas proteínas de interés en las células usando una etiqueta de cierre. Aquí aplicamos este método a células madre embrionarias (ES) de ratón cultivadas en la E-cadherina, pero debería ser posible usarlo con cualquier tipo de cultivo de células adherentes. Demostramos que pulso etiquetado complemento etiqueta proteínas de fusión seguidas por imágenes de Time-lapse de fluorescencia permite determinar la vida media de unicelular de diferentes proteínas de interés y proporciona una estimación de la variabilidad de célula a célula de vida media en un población de células cultivadas.