Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.
Abstract
Le proteine sono in uno stato dinamico di sintesi e degradazione e la loro emivita può essere regolata in varie circostanze. Tuttavia, la maggior parte comunemente utilizzati approcci per determinare l’emivita della proteina o sono limitate a medie della popolazione dalla cellule lisate o richiedono l’uso di inibitori della sintesi di proteina. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la proteina emivite in singole cellule aderenti, con proteine di fusione SNAP-tag in combinazione con Time-lapse microscopia di fluorescenza. Qualsiasi proteina di interesse fusa ad un SNAP-tag possa legarsi covalentemente da una tintura di permeabili delle cellule fluorescente, che è accoppiata ad un derivato di benzylguanine, e il decadimento della popolazione proteina marcata può essere monitorato dopo interruzione della tintura residua. Successiva delle cellule di rilevamento e la quantificazione dell’intensità di fluorescenza integrata rispetto ai risultati di tempo in una curva di decadimento esponenziale per ogni cella cingolato, permettendo per determinare i tassi di degradazione delle proteine in cellule singole di adattamento della curva. Questo metodo fornisce una stima per l’eterogeneità delle emivite in una popolazione di cellule in coltura, che non può essere valutato facilmente con altri metodi. L’approccio qui presentato è applicabile a qualsiasi tipo di cellule aderenti coltivate che esprime una proteina di interesse fusa a un tag di SNAP. Qui usiamo cellule staminali embrionali (ES) topo coltivate su piastre per colture cellulari E-cadherin-rivestito per illustrare come singola cella degradazione tassi di proteine con una vasta gamma di dimezzamento possono essere determinati.
Introduction
È noto che proteine cellulari subiscono ampio turnover, con tassi di sintesi e degradazione essendo specifico per ogni proteina e soggette a regolazione fisiologica. Tradizionalmente, tassi di degradazione delle proteine sono stati misurati utilizzando metodi di massa, quali l’analisi di chase impulso radioattivo, o che coinvolgono gli inibitori della sintesi di proteine quali cicloesimmide1. Più recentemente, isotopo stabile etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC) in combinazione con la spettrometria di massa è stato istituito per quantificare il turnover delle proteine su una scala globale2. Tuttavia, questi metodi sono limitati da una media di popolazione e informazioni sulla variabilità della cellula–cellula sono quindi persi. Inoltre, i cambiamenti transitori nella degradazione delle proteine che non sono sincronizzati in tutta la popolazione delle cellule non possono essere identificati.
In alternativa, emivite di proteina possono essere determinate anche da approcci basati sulla fluorescenza, che spesso hanno il vantaggio di fornire la risoluzione di singole cellule. Ad esempio, una proteina fluorescente verde fuse (paGFP) è stata utilizzata per determinare Oct4 emivita in embrione dei mammiferi primi3. Un altro metodo per monitorare il decadimento della proteina in cellule viventi è l’uso di un tag di SNAP in combinazione con Time-lapse imaging di fluorescenza. Il tag di SNAP è una versione mutante del DNA riparazione enzima O6– alchilguanina DNA-alchiltransferase (AGT) che reagisce specificamente con benzylguanine derivati (BG), che possono essere accoppiati a sonde molecolari4,5, 6. di conseguenza, qualsiasi proteina di fusione SNAP-tag può essere irreversibilmente etichettata con un colorante fluorescente, di permeabili delle cellule. Impulso di etichettatura di una proteina di interesse fusa per il SNAP-tag, seguito da interruzione della tintura residua, permette per il monitoraggio del degrado della popolazione proteina marcata e così per determinare il tempo di dimezzamento della proteina. SNAP-tag sono stati utilizzati con successo per impulso-insegua etichettatura delle proteine e per la determinazione della proteina emivite in aderente delle cellule di cultura ed in vivo5,7,8,9. Una grande varietà di substrati SNAP-tag che coprono comunemente usato fluorescente spectra è disponibili in commercio, consentendo la selezione della tintura ottima per ogni specifica applicazione. Così, SNAP-tag possono essere utilizzati anche per l’imaging multicolore in combinazione con altre proteine di fusione fluorescenti o coloranti. Cella-impermeabile coloranti sono adatti per l’etichettatura delle proteine di membrana-legato, mentre cellula-permeabile coloranti sono applicabili per il monitoraggio di proteine intracellulari e di membrana-limitano. Inoltre, alcune di queste sonde non presentano quasi nessuna fluorescenza basale e solo avviare l’emissione di un segnale fluorescente forte legandosi ad un SNAP-tag10.
Questo protocollo viene descritto come misurare i tassi di degradazione delle proteine differenti di interesse in singole cellule utilizzando un tag di SNAP. Qui abbiamo applicare questo metodo a cellule staminali embrionali (ES) topo coltivate su E-caderina, ma dovrebbe essere possibile usarlo con qualsiasi tipo di cellule in coltura aderente. Indichiamo che impulso etichettatura delle proteine di fusione SNAP-tag seguite da formazione immagine di fluorescenza time-lapse consente di determinare le emivite unicellulare di varie proteine di interesse e fornisce una stima della variabilità della cellula–cellula di emivite in un popolazione di cellule coltivate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il passaggio più importante quando si utilizza un tag di SNAP per monitorare il decadimento della proteina è per garantire che nessun residuo colorante non legato è lasciato nel terreno o nelle cellule dopo il lavaggio, altrimenti si potrebbe associare a recentemente prodotte molecole SNAP-tag più tardi nel corso dell’esperimento e ther Eby compromesso la curva di decadimento. Questo è un lato ottenuta eseguendo attentamente tutti i passaggi di lavaggio descritta. D’altra parte, la concentrazione di colorante dovreb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esperimenti di microscopia time-lapse sono stati eseguiti presso biomolecolari Screening Facility (BSF), EPFL. Ringraziamo Marc Delachaux (servizio Audiovisuel, EPFL) per la videografia e montaggio del film.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
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