השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים
Summary
אנו מתארים הליך פתולוגיה המגלה אבץ למינריות, אריאל האופיינית מכתים דפוסי באזורים שונים במוח. התבנית מכתים אבץ עשוי לשמש בשילוב עם סמנים אנטומיים אחרים להבחין בצורה אמינה שכבות של אזורים במוח המתפתח, למבוגרים.
Abstract
אפיון של הארגון האנטומי ופונקציונלי המוח ופיתוח דורש זיהוי מדויק של המעגלים העצביים ברורים אזורים במוח ילדותי. ולא למבוגרים. כאן נתאר אבץ פתולוגיה מכתימים הליך זה מגלה הבדלים בדפוסי מכתימים בין שכבות שונות ואזורי המוח. אחרים נעזרו הליך זה לא רק כדי לחשוף את ההתפלגות של נוירונים, מעגלים במוח המכילים אבץ, אלא גם על בהצלחה גבולות אמיתיות ולא למינריות במוח המתפתח, למבוגרים מספר מינים. כאן אנחנו להמחיש זאת מכתים הליך עם תמונות של פיתוח והמוח פארט למבוגרים. אנחנו חושפים תבנית מכתים אבץ משמש סמן האנטומי של אזורים ושכבות, יכול לשמש באופן אמין להבחנה חזותית באזורים קורטיקליים הראייה בקליפת המוח המתפתח, למבוגרים. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להציג שיטה פתולוגיה המאפשר זיהוי מדויק של שכבות, אזורים במוח המתפתח, למבוגרים בו שיטות אחרות לא תעשה. שנית, בשילוב עם ניתוח תמונות densitometric, שיטה זו מאפשרת לו להעריך את ההתפלגות של אבץ סינפטית לחשיפת פוטנציאל שינויים במהלך הפיתוח. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ריאגנטים, ‘ כלים ‘ השלבים הנחוצים להפיכת במרוכז כתם מוח קפוא מקטעים. למרות פרוטוקול זה מתואר באמצעות רקמת המוח חמוס, זה בקלות יכול להיות מותאם לשימוש מכרסמים, חתולים או קופים גם ואזורים נוספים במוח.
Introduction
כתמי היסטולוגית שימשו באופן מסורתי כדי לסייע בזיהוי אזורים קורטיקליים במינים שונים על ידי חשיפת ההבדלים בתכונות ארכיטקטוני. השימוש המשולב של פתולוגיה טכניקות כגון חומר Nissl, תגובתיות ציטוכרום אוקסידאז (CO) או המיאלין יכול להוכיח פורה כפי הם חושפים דומה גבולות המכסים איזורים במוח למבוגרים. עם זאת, הכתמים פתולוגיה האלה לא תמיד מספקת לחשוף גבולות ברורים בין אזורים קורטיקליים ושכבות במוח לא בוגר.
במערכת העצבים המרכזית, אבץ יש כמה תפקידים קריטיים הכוללים ייצוב מבנה ה-DNA, מתנהג כמו קופקטור האנזים, השתתפות פונקציות רגולטוריות רבות, מתנהג כמו המודל העצבי דרך נוכחותה הסינפטיות 1. אבץ סינפטית היא ייחודית כמו זה ניתן לאבחן באמצעות שיטות היסטולוגית, ואילו חלבון מכורך אבץ לא יכול להיות מטמיעים2. תכונה זו נוצלה כדי לחשוף את התבנית אבץ סינפטית אזורים קורטיקליים שונים, אבץ סינפטית להסטולוגיה שימש במספר מחקרים. תת-קבוצה של glutamatergic נוירונים בקליפת מכילים אבץ השלפוחיות המוגלתיות presynaptic בתוך3,שלהם מסופי האקסון4. לימודי מעבדה הומנית נחשפו התפלגות הטרוגנית של אבץ סינפטית קליפת המוח5,6,7. נראה שיש חלוקה אמיתיות ולא למינריות שונה של האבץ ריאקטיבי histochemically אזורים קורטיקליים שונים (למשל, חזותית לעומת קליפה המגע), או שכבות (למשל, רמות אבץ supragranular, שכבות infragranular של קליפת הראיה העיקרית הם התלמידות-גבוה בהרבה thalamocortical קלט שכבה IV עם רמות אבץ סינפטית נמוכה יחסית)5,8,9. הטרוגניות של אבץ סינפטית מכתים שנצפתה קליפת יש יתרון במיוחד הוא מקל זיהוי אמיתיות, אביזרים.
כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הליך פתולוגיה אבץ סינפטית, אשר יש את הגירסה של Danscher-1982-שיטה-10. שיטה זו משתמשת הסלנייט מוזרק intraperitoneally (IP) חיות כמו חומר מכלט. הסלנייט נוסע אל המוח כדי להגיב עם שלוליות חינם אבץ שנמצאו ב שלפוחית של קבוצת משנה של glutamatergic הסינפסות במוח. התגובה הזו מניבה התמיסה זה יכול להיות מוגברת לאחר מכן על ידי פיתוח כסף2,10,11.
הליך זה חושף למינריות אמיתיות דפוסי אבץ סינפטית מכתימה; ניתוח densitometric עשוי לשמש כדי להעריך הדפוסים הללו איכותית והן באופן כמותי במוח למבוגרים ולא בוגרת כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות אחרות, כגון מניפולציות חושית, איכות הסביבה, תרופתי או גנטית. יתר על כן, אחד מומלץ גם להעריך את פוטנציאל שינויים התפתחותיים בתחום ההפצה של אבץ סינפטית במבנים אחרים בקליפת המוח או subcortical במערכות אחרות מודל. המידע הכמותי המספק ניתוח densitometric בשיטה זו יכול להיות יתרון להתפתחות המוח הבאות לאורך זמן. פרוטוקול זה מספק חבר של אחרים חיסונית – וסמנים פתולוגיה כדי לחשוף את גבולות למינריות ולא אמיתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי מעסיקה פתולוגיה טכניקה המבוססת על גירסה שונה של Danscher (1982) שיטת10, לפיו אבץ סינפטית לוקליזציה ייתכן ועוזרת דמיינו במוח. שיטה זו פועלת בעיקר באמצעות הזרקת החיה עם הסלנייט נתרן chelator אבץ (נה2SeO3) (15 מ”ג/ק”ג). בעקבות זריקה, סלנייט נוסע אל המוח ומאגד אבץ חינם זה הו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך על ידי מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (2G12RR03060-26A1); המכון הלאומי על מיעוט בריאות פערים בשרותי בריאות (8G12MD007603-27) מ המכונים הלאומיים לבריאות; צוות מקצועי הקונגרס-סיטי יוניברסיטי בניו-יורק (PSC-הנטר); ומחקר בפקולטה גרנט (FRG II) האוניברסיטה האמריקאית של שארג’ה. אנו מודים Vidyasagar Sriramoju על שהכרת בינינו לשיטות אלו.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
