Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood
Summary
We illustreren een straight-forward methode om te ontlenen lymfkliertest primaire macrofagen van beenmergcellen en een eenvoudige methode om te bereiden BSA-vetzuur conjugaten. Dan tonen we dat verzadigde vetzuren leiden de dood van de cel van de macrofaag tot kan, en dergelijke celdood positief geassocieerd met cellulaire accumulatie van ceramide niveaus wordt.
Abstract
Macrofagen express zeer epidermale vetzuur-bindend-proteïne en obesitas vetzuur-bindend-proteïne. Zij actief opname verzadigde en onverzadigde vetzuren, die een cruciale rol spelen kan bij het reguleren van hun immuun functies. Talrijke studies hebben aangetoond dat verschillende vetzuren, verzadigde of onverzadigde, mei bezitten verschillende gevolgen voor celgroei en functie. Echter, de benaderingen die zijn gebruikt voor de voorbereiding van het vetzuur verschillen, die kan leiden tot niet-fysiologische resultaten. Serumalbumine, een natuurlijke drager voor vetzuren in perifeer bloed van zoogdieren, wordt aanbevolen voor het vormen van een conjugaat complex met het natriumzout van vetzuren te bestuderen van de functie van de vetzuren in de cellen van de zoogdieren, dus het minimaliseren van de toxiciteit van vetzuur zeep. Dus, is een eenvoudige, relatief snelle verwarming en sonicating methode ontwikkeld en gepresenteerd hier voor BSA-fatty acid geconjugeerde vorming. We beschrijven de verzadigde vetzuren, vooral stearic zuur veroorzaken ernstige celdood in muis beenmerg-afgeleide macrofagen die gebruikmaakt van een protocol. We zijn het er verder laten zien dat verzadigde vetzuren-veroorzaakte celdood positief geassocieerd met de geaccumuleerde cellulaire ceramide niveaus wordt. Deze methode kan worden uitgebreid voor studies van de gevolgen van vetzuur op andere cellen van zoogdieren.
Introduction
Vetzuren spelen een cruciale rol in energiemetabolisme en de synthese van membraan fosfolipiden in verschillende soorten cellen. Vetzuren hebben een lage oplosbaarheid in water. Passende voorbereiding van vetzuur is van cruciaal belang voor het bestuderen van de biologische functies van vetzuren in zoogdiercellen. Wanneer vetzuren worden bereid met ethanol, kan veel vetzuren laten zien van hun giftige zeep (detergenten) effect op de celmembraan, zelfs op relatief lage concentraties1. Als een natuurlijke, grote vervoerder voor vrije vetzuren in het serum, serumalbumine wordt beschouwd als een goede drager voor vetzuur levering in vitro vetzuur functie testen2,3,4. De details van de voorbereiding van vetzuur en serumalbumine conjugaat zijn echter meestal niet beschikbaar alhoewel veel werkstukken met behulp van vetzuren zijn gepubliceerd.
Macrofagen express zeer epidermale vetzuur-bindend-proteïne en obesitas vetzuur-bindende eiwit5,6,7,8. Zij actief opname verzadigde en onverzadigde vetzuren die hun immuun functies kunnen reguleren. Om te bestuderen van de impact van vetzuren op de macrofagen en andere cellen, werden verschillende methoden van vetzuur voorbereiding toegepaste1,7,9. Het gebruik van op de juiste manier bereid vetzuur/serum albumine geconjugeerde te onderzoeken van het effect van vetzuren op macrophage functie is van cruciaal belang bij het verkrijgen van biologisch relevante gegevens. Studies over de invloed van vetzuren macrofaag-functie kunnen gebruikers basiskennis en potentiële therapeutische streefniveaus met betrekking tot de vetzuurstofwisseling in macrofaag-betrokken ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De juiste voorbereiding van vetzuur oplossing is van essentieel belang zijn voor het bestuderen van de biologische functie van vetzuren. De neutralisatie van vetzuur verhoogt de oplosbaarheid in waterige oplossing. Natrium zouten van vetzuren, vooral verzadigde vetzuren, zijn echter nog steeds van lage oplosbaarheid in water of PBS zoals we waargenomen. Een methode is het gebruik van 95-100% ethanol te ontbinden vetzuur1. Met behulp van deze methode, kan hogere toxiciteit voor cellen zelfs bij lag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Louisville start-up fondsen en National Cancer Institute (Bethesda, MD) verleent R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
