שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans
Summary
כלים חדשים למחקר mechanobiology יש צורך להבין כיצד מכאניים מפעילה מסלולים ביוכימיים, מעורר תגובות ביולוגיות. כאן, אנחנו ראווה שיטה חדשה עבור סלקטיבית גירוי מכני של חיות קיבוע עם מלכודת microfluidic ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תגובות הסלולר.
Abstract
מטרה מרכזית אחת של mechanobiology הוא להבין את השפעת הגומלין לחץ מכני על חלבונים ותאים. למרות חשיבותו, השפעת לחץ מכני על תפקוד התאים עדיין ממעטים להבין. בחלקו, הפער בידע קיים בגלל כמה כלים להפעיל בו זמנית דפורמציה של רקמות ותאים, הדמיה של פעילות תאית בבעלי חיים, הגבלת יעיל של תנועתיות אורגניזמים דגם אחרת מאד ניידים, כגון תולעים נימיות Caenorhabditis elegans. גודל קטן של C. elegans גורם להם קשר מצויין למכשירים מבוססי מיקרופלואידיקה מחקר, פתרונות עבור קיבעון הוצגו באמצעות מכשירי microfluidic. אף על פי התקנים אלה לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, החיה הוא מלא עטוף polydimethylsiloxane (PDMS) וזכוכית, הגבלת גישה פיזית למשלוח בכוח מכני או הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לאחרונה, יצרנו מכשיר המשלב גלילי עם עיצוב השמנה התואמת למיקרוסקופיה פלורסצנטיות ברזולוציה גבוהה. הערוץ הופעה מופרדת מן התעלה תולעת-השמנה באמצעות בדיאפרגמה PDMS דק. הסרעפת הוא הסיט לתוך הצד של תולעת על ידי הפעלת לחץ ממקור חיצוני. המכשיר ניתן לייעד נוירונים בודדים mechanosensitive. ההפעלה של הנוירונים הללו הוא עם תמונה ברזולוציה גבוהה עם מחוון בקידוד גנטית סידן. מאמר זה מציג את השיטה הכללית באמצעות C. elegans זנים לבטא מחוון הפעילות רגיש סידן (GCaMP6s) בנוירונים קולטן שלהם מגע (TRNs). השיטה, אולם אינה מוגבלת TRNs או חיישנים סידן כמו החללית, אלא ניתן להרחיב אחרים תאים רגישים מכנית או חיישנים.
Introduction
חוש המגע מספקת חיות עם מידע חיוני על הסביבה שלהם. בהתאם הכוח יישומית, מגע נתפשת גם לא מזיק, מענג או כואב. להרכב רקמות במהלך המגע הוא זוהה על ידי תאים מיוחדים mechanoreceptor מוטבע בתוך העור המבטאים קולטן חלבונים, לרוב תעלות יונים. השלבים קישור תפיסה כוח יון הפעלת הערוץ במהלך מגע וכאב אינם מובנים במלואם. אפילו פחות ידוע על מה רקמות העור מסננים דפורמציה מכאנית, אם mechanoreceptors לזהות שינויים זן או להדגיש1,2,3. פער זה בהבנה נובע, בין השאר, חוסר הכלים המתאימים כדי להחיל stimulations מכניים מדויקים על פני השטח של העור של חיים תוך התבוננות התגובות ברמה התאית. ואילו מיקרוסקופ כוח אטומי נעשה שימוש נרחב כדי להחיל ולמדוד את כוחות תאים מבודדים4,5 , גם כדי להפעיל את קולטני Piezo1 חי תאים6, ניסויים דומים באמצעות בעלי חיים, במיוחד C. elegans, היו לשמצה מאתגר עקב ניידות פנימית של הנושא. אתגר זה הוא מצויין באופן מסורתי באמצעות דבק cyanoacrylate וטרינרית או כירורגי-כיתה על מנת לשתק חיות בודדות על אגר רפידות1,7,8,9. גישה זו כבר פרודוקטיבי, אבל יש מגבלות הקשורות את המיומנות הדרושה הנייח על ידי הדבקת פני השטח אגר רך על ציות מכני. אסטרטגיה מיקרופלואידיקה הוא חלופה ללא תשלום זה מונע כמה סיבוכים הקשורים הדבקה.
תולעים נימיות C. elegans הוא אורגניזם מודל גנטי עם מערכת העצבים לחלוטין ממופה, בשל הגודל של החיה, היא מתאימה לטכנולוגיה מיקרופלואידיקה. מכשירים מבוססי מיקרופלואידיקה ההצעה יתרון כי החיות אחרת מאד ניידים יכול לרסנם בעת ביצוע הדמיה ברזולוציה גבוהה ואספקה של גירויים נוירו-modulatory רלוונטיים. עם העזרה של microfluidic טכנולוגיות, חיים בעלי חיים יכול להיות משותק ללא נזק10,11, המאפשר ניטור פעילות התנהגותית מעל12,שלמים13 ברזולוציה גבוהה הדמיה של פעילות. עצבית14,15,16,17. יתר על כן, נוירונים mechanoreceptor רבים הדרושים לצורך ניתן לאפיין את תחושת מגע וכאב שלהם פיזיולוגית1,8, מכני4,18,19, ומולקולרית ברמה20,21,22.
C. elegans החושים גירויים מכני עדין לקיר הגוף שלה באמצעות TRNs שש, שלוש מהן innervate של החיה הקדמי (ALML/R ו- AVM), מתוכם 3 innervate אחוריים של החיה (PLML/R ו PVM). מולקולות ערוץ יון הדרושים transducing כוח יישומית לתוך אות הביוכימי נחקרו בהרחבה ב- TRNs8. מאמר זה מציג על פלטפורמה microfluidic23 המאפשרת לחוקרים להחלת כוחות מכניים מדויקים על העור של קיבוע C. elegans העגולה, תוך כדי קריאת החוצה את דפורמציה של רקמות פנימיות שלה על ידי הדמיה אופטית. בנוסף מציג גירויים מכניים מוגדרים היטב, סידן שנחשולי יכול להיות מוקלט בנוירונים mechanoreceptor עם רזולוציה subcellular, בקורלציה עם תכונות מורפולוגיים האנטומי. המכשיר מורכב ערוץ השמנה מרכזית מחזיק חיה יחידה ומציג את עורה ליד שישה ערוצים הופעה פנאומטיים (איור 1 ואיור 2). שישה ערוצים ממוקמות לאורך הערוץ השמנה לספק גירויים מכניים לכל אחד TRNs 6 של התולעת. ערוצים אלה מופרדים מן החדר השמנה באמצעות דיאפרגמות PDMS דק, אשר יכול להיות מונע על ידי מקור לחץ אוויר חיצוני (איור 1). מכויל על סטיה ביחס ללחץ ואנו מספקים את המידות במאמר זה. כל מפעיל יכול להיות התייחס בנפרד, להשתמש בו כדי לעורר את mechanoreceptor של בחירה. הלחץ מועבר באמצעות משאבה ללחץ מונחה piezo אך ניתן להשתמש בכל מכשיר חלופי. אנחנו מראים כי פרוטוקול לחץ יכול לשמש כדי להפעיל TRNs ויוו ומדגימים התקני הפעלה מתאים אספקת גירויים מכניים למבוגרים C. elegans, טעינת למבוגרים בעלי חיים לתוך מכשירים, ביצוע הדמיית סידן ניסויים, וניתוח התוצאות. ייצור המכשיר מורכבת משני שלבים עיקריים: 1) פוטוליתוגרפיה לעשות תבנית מ סו-8; ו- 2) צורניים PDMS כדי להפוך התקן. למען תמציתיות ובהירות, הקוראים נקראים שפורסמו בעבר מאמרים ופרוטוקולים24,25 להוראות כיצד לייצר את תבניות וההתקנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מדגים שיטה להעברת גירוי מכני מדויק על העור של התולעת העגולה לכוד בתוך שבב microfluidic. הוא נועד להקל על קליטת גירויים הפיזי למענה על שאלות ביולוגיות, שמטרתו לייעל את mechanobiology מחקר במעבדות ביולוגיות. שיטה זו מרחיבה מבחני הקודם כדי להעריך את הפונקציה של נוירונים mechanosensory C. elegans. טכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סנדרה ש Manosalvas-Kjono, פורים Ladpli, פארה ממון, דיוויה Gopisetty וורוניקה סנצ’ז עבור תמיכה עיצוב המכשיר, דור של חיות. מחקר זה נתמך על ידי NIH מענקים R01EB006745 (קרית אתא), R01NS092099 (כדי מדיניות החזרה), K99NS089942 (כדי ח”כ), F31NS100318 (כדי ALN) ומימון שהתקבלה מ אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת אופק 2020 מחקר וחדשנות של האיחוד האירופי התוכנית ( להעניק הסכם מס 715243 ח”כ).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
