Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren
Summary
Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.
Abstract
Eine Reihe von Methoden wurden beschrieben, NK/T-Zell-Linien von Patienten mit Lymphom oder Lymphoproliferative Syndrome zu etablieren. Diese Methoden angewendet Feeder-Zellen, gereinigten NK oder T-Zellen mit mehr als 10 mL Blut oder eine hohe Dosis von IL-2. Diese Studie stellt eine neue Methode, eine leistungsstarke und einfache Strategie zu etablieren, dass NK und T-Zell-Linien durch Kultivierung der peripheren Mononukleäre Zellen (PBMC) Blut mit dem Zusatz von rekombinanten menschlichen Il-2 (RhIL-2) und weniger als 2 mL Vollblut verwendet. Die Zellen können in zwei Wochen schnell vermehren und für mehr als 3 Monate gehalten werden. Mit dieser Methode wurden 7 NK oder T-Zell-Linien mit einer hohen Erfolgsquote eingerichtet. Diese Methode ist einfach, zuverlässig und für Schaffung Zelllinien aus mehr Fälle von CAEBV oder NK/T-Zell-Lymphom.
Introduction
Epstein – Barr-Virus (EBV) ist allgegenwärtig und befällt nicht nur B-Zellen, sondern auch T und natürlichen killer (NK)-Zellen, wodurch eine Reihe von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen (LPD) und Lymphom/Leukämie, wie z. B. EBV-assoziierten hemophagocytic Lymphohistiocytosis, Hydroa Vacciniforme-wie Lymphom, extranodal NK/T-Zell-Lymphom, nasale Art und aggressive NK Zell-Leukämie1,2,3. Unter diesen ist schwerer chronisch aktive EBV (SCAEBV) Erkrankung, die einfallenden vor allem in Ostasien, und das gilt jetzt als ein LPD verursacht durch klonale Expansion von EBV-infizierte T oder NK Zellen4,5,6, 7, aber ohne die scheinbare Immunschwäche präsentieren in infektiöse Mononukleose (IM)-wie Symptomen wie Fieber, Hepatosplenomegalie, Lymphadenopathie und Leberfunktionsstörungen, anhaltend oder wiederkehrend sowie hohen EBV-DNA in die peripheren Blut8,9. Patienten mit CAEBV haben eine schlechte Prognose10,11, und seine Pathogenese und die Rolle der EBV ist unklar. Daher Zellinien von EBV-assoziierten NK/T Lymphoproliferative Erkrankungen abgeleitet und Lymphome sind sehr hilfreich, wie Zellmodelle für Klärung des Mechanismus der EBV NK oder T-Zell-Proliferation und seine Beziehung mit hoher Inzidenz von Leukämie induziert oder Lymphom.
Bislang wurden mehrere Zellinien mit verschiedenen Techniken12,13,14,15,16eingerichtet. Eine menschliche NK-Zell-Linie, NK-YS, entstand von NK-Zellen-Lymphom/Leukämie, durch Kultivierung zusammen mit einer Maus Stromazellen Zelllinie als Zubringer und in Anwesenheit von RhIL-2 in einer Konzentration von 20U pro mL15. KAI3 war ein weiterer NK-Zell-Linie gegründet von Patienten mit einer schweren Moskito-Allergie oder SCAEBV mit autologen Lymphoblastoid Zelllinie (LCL), B-Zellen durch EBV, als Feeder-Zellen und Zugabe von RhIL-2 bei 100U/mL16verwandelt. SNK6 und SNT8 wurden von Tumorgewebe des nasalen NK/T Zelle Lymphom Patienten abgeleitet, durch Zugabe von Hochdosis-RhIL-2 (700U/mL)12. Mit ähnlicher Technik war die SNK-1 Zelle von CAEBV Patienten, kultiviert von PBMC durch T-Zellen entfernen und Hinzufügen von 700U/mL RhIL-213,17. SNT13 und SNT15 wurden durch Entfernen von CD4 + und CD8 + Zellen18gegründet. Bisher wurden alle anderen T-Zellen und NK-Zell-Linien von EBV-NK/T LPD Patienten mit dieser Methode19entwickelt.
Die Nachteile der oben erwähnten vorhandenen Methoden gehören die Beschäftigung von Feeder-Zellen, das Erfordernis einer hohen Dosis von IL-2, die Auslastung von mehr als 10 mL Vollblut oder die Reinigung von NK/T-Zellen, die sehr anspruchsvoll in der Klinik die Notwendigkeit der Überprüfung, welche Arten von Zellen, dass EBV latent infiziert vor Beginn der Kultur. Als CAEBV vor allem bei Kindern in Asien tritt, ist 10 mL Blut nicht einfach, in allen Regionen zu erwerben. In dieser Studie haben wir eine neue einfache Methode mit einer hohen Erfolgsquote, NK und/oder T-Zell-Linien zu etablieren, durch Kultivierung PBMC von CAEBV Patienten mit niedrig dosierten rhIL2 und ein Volumen von 2 mL Vollblut ohne Feeder-Zellen entwickelt. Die Ergebnisse dieser Methode haben ihre hohe Effizienz und Zeitersparnis bewiesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll wurde eine neuartige Technik für den Aufbau von NK/T-Zell-Linien aus dem Vollblut von CAEBV Patienten entwickelt. Im Vergleich mit den bisherigen Verfahren, ist der Hauptvorteil dieser Methode seiner Einfachheit und seiner Forderung nach nur ein kleines Volumen des Blutes, während es eine hohe Erfolgsquote und gute Bedingungen der Zellviabilität aufweist. Darüber hinaus können NK/T-Zell-Linien eingerichtet werden, durch Kultivierung PBMC ohne festzustellen, dass die Zelltypen der EBV latent infiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Schlüssel Projekte der chinesischen Akademie der Wissenschaften (KFZD-SW-205), strategische biologische Ressourcen Technologie-Support-System der chinesischen Akademie der Wissenschaften (CZBZX-1 und ZSSB-004) und durch Zuschüsse vom National Science Foundation of China (unterstützt 81401640) und Shanghai Natural Science Fund (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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