Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato
Summary
É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.
Abstract
Descreveremos um protocolo eficiente e reproduzível para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto, um tecido resistente fisicamente com um alto teor de proteínas estruturais. Músculos de membros dissecados de ratos adultos fisicamente são rompidos por homogeneização mecânica, ou uma combinação de picagem e douncing, em um buffer hipotônica antes da fixação de formaldeído do lisado celular. Os núcleos fixos são purificados por mais ciclos de homogeneização mecânica ou douncing e filtrações sequenciais para remover os resíduos de célula. Os núcleos purificados podem ser sonicated imediatamente ou posteriormente após congelamento. A cromatina pode ser sonicated com eficiência e é apropriado para experimentos de imunoprecipitação da cromatina, conforme ilustrado pelos perfis obtido por fatores de transcrição, RNA polimerase II e modificações do histone covalente. Os eventos de ligação detectados usando cromatina preparada pelo presente protocolo predominantemente são aqueles que ocorrem no núcleo da fibra muscular apesar da presença de cromatina de outro satélite de fibra-associado e células endoteliais. Este protocolo, portanto, é adaptado para estudar a regulação gênica no músculo esquelético rato adulto.
Introduction
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) acoplado a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e sequenciamento de alto throughput (ChIP-seq) tornaram-se os métodos de escolha para estudar a transcrição e epigenética regulação da expressão gênica em diversos tecidos e tipos de células1. Esta técnica permite a criação de perfil de todo o genoma de modificações covalentes cromatina, ocupação variante de histona e32,ligação do fator da transcrição.
Enquanto executando o ChIP de células cultivadas está bem estabelecida, ChIP de tecidos de mamíferos permanece mais desafiador. Preparação da cromatina para ChIP envolve várias etapas críticas que precisam ser otimizados para cada tipo de tecidos e células. Cromatina pode ser preparada do lisado celular de células cultivadas ou seguir a purificação de seus núcleos. No caso de tecidos de mamíferos, Lise eficiente, fixação de formaldeído e purificação dos núcleos são críticos para garantir ótima recuperação da cromatina. Além disso, a escolha de se corrigir os núcleos antes ou depois da sua purificação tem de ser determinado experimentalmente. Apesar destes obstáculos, ChIP tem sido realizado com sucesso de tecidos como o fígado, testículo ou cérebro4,5,6. No caso de músculo esquelético, o rompimento de um tecido tão fisicamente resistente, que apresenta um alto teor de proteínas estruturais e isolamento de seus núcleos é particularmente desafiadora. Tendo em conta esta especificidade, protocolos otimizados para outros tecidos não dão resultados satisfatórios para os músculos esqueléticos.
Aqui descrevemos um protocolo para isolar a cromatina ChIP-grau de tecido de músculo esquelético de rato que envolve fisicamente, rompendo o tecido, fixação de formaldeído e então o isolamento dos núcleos e sonication. A eficiência deste método para preparar a cromatina apropriada para ChIP deste tecido foi demonstrada por realização de ChIP-qPCR e ChIP-seq para vários fatores de transcrição, RNA polimerase II e de modificações do histone covalente7.
Esta nova técnica é muito mais rápida do que um protocolo relatado anteriormente8 composto por etapas de digestão tempo colagenase durante esse tempo, mudanças na localização de genômica de factores de transcrição e alterações na expressão do gene podem ter lugar. A rapidez com que os núcleos são isolados e fixa faz com que o método descrito aqui particularmente atraente para preparar a cromatina que capta mais fielmente o estado de ocupação genômica nativo. Além disso, apesar de tem outros métodos de extração de isolamento ou proteínas da cromatina de tecido muscular foram descritas8,9,10 e usado para experiências de ChIP-qPCR genes selecionados, sem ChIP-seq dados tem sido relatados como usá-los. O método relatado aqui é apropriado para transcrição fator e histona modificação ChIP-seq e, portanto, deve ser também apropriado para aplicações de captura do HiC cromatina conformação ou 3 / 4C.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um novo protocolo para a preparação de cromatina de músculos esqueléticos de rato adulto e mostrar que este cromatina é adequada para experimentos de ChIP que detectar a ligação do fator de transcrição e modificações do histone covalente no núcleo da fibra muscular. Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é rompimento de tecido que pode ser executado por homogenizacao ou por cisalhamento mecânico. O corte mecânico é mais rápido e mais reprodutíveis e é, portant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os funcionários da facilidade de sequenciamento de alta taxa de transferência IGBMC, um membro do consórcio “França Génomique” (ANR10-INBS-09-08) e todos os serviços IGBMC gerais em particular os funcionários do centro de animais IGBMC. Este trabalho foi apoiado por concessões do CNRS, o INSERM, o AFM, a Ligue Nationale contre le Cancer, do Estado francês fundo através da ANR no âmbito do programa d’Avenir Investissements rotulados ANR-10-IDEX-0002-02, o Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e a ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sambakana foi suportada pelo Ligue Nationale contre le Cancer e o ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U o Ministère de l’Enseignement et de la Recherche. ID é uma ‘équipe labellisée’ da Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
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