Protocole amélioré pour l’immunoprécipitation de la chromatine du Muscle squelettique de souris
Summary
Un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes adapté à l’étude de la régulation génique dans les fibres musculaires par immunoprécipitation de la chromatine est présenté.
Abstract
Les auteurs décrivent un protocole efficace et reproductible pour la préparation de la chromatine du muscle squelettique de souris adultes, un tissu résistant physiquement avec une teneur élevée en protéines structurales. Disséqué les muscles de souris adultes sont physiquement perturbés par homogénéisation mécanique, ou une combinaison de hacher et de douncing, dans un tampon hypotonique avant la fixation de formaldéhyde du lysat cellulaire. Les noyaux fixes sont purifiés par des cycles supplémentaires d’homogénéisation mécanique ou douncing et filtrations séquentielles pour éliminer les débris cellulaires. Les noyaux purifiés peuvent être sonication immédiatement ou ultérieurement après congélation. La chromatine peut être efficacement sonication et est approprié pour les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, comme le montrent les profils obtenu pour des facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et modifications d’histone covalente. Les liaison des événements détectés à l’aide de la chromatine, établie par le présent protocole sont principalement ceux qui se produisent dans le noyau de la fibre musculaire malgré la présence de la chromatine des autres satellites associés aux fibres et les cellules endothéliales. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation génique dans le muscle squelettique de souris adulte.
Introduction
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplée à la PCR quantitative (qPCR) et séquençage à haut débit (ChIP-seq) sont devenues les méthodes de choix pour étudier la transcription et de la régulation épigénétique de l’expression génique dans divers tissus et types de cellules1. Cette technique permet de tout le génome de profilage de modifications de la chromatine covalent, occupation variant d’histone et transcription factor binding2,3.
Interprétant des puces de cellules cultivées est bien établie, une puce de tissus de mammifères reste plus difficile. Préparer la chromatine ChIP implique plusieurs étapes essentielles qui doivent être optimisées pour chaque type de tissus et de cellules. Chromatine peut être préparée à partir les lysats cellulaires des cellules cultivées ou purification suivante de leurs noyaux. Dans le cas de tissus de mammifères, lyse efficace, fixation de formaldéhyde et de purification des noyaux sont essentiels pour assurer un recouvrement optimal de la chromatine. En outre, le choix s’il convient de fixer les noyaux avant ou après leur purification doit être déterminée expérimentalement. Malgré ces obstacles, ChIP a été effectué avec succès des tissus tels que le foie, testicules ou cerveau4,5,6. Dans le cas du muscle squelettique, perturbation d’un tissu résistant physiquement, qui présente une teneur élevée en protéines de structure et l’isolation de ses noyaux est particulièrement difficile. Compte tenu de cette spécificité, protocoles optimisés pour les autres tissus ne donnent pas des résultats satisfaisants pour les muscles squelettiques.
Nous décrivons ici un protocole afin d’isoler la chromatine ChIP-grade du tissu de muscle squelettique de souris qui consiste à perturber physiquement le tissu, la fixation de formaldéhyde et puis l’isolement des noyaux et sonication. L’efficacité de cette méthode pour préparer la chromatine convenant à la puce de ce tissu a été démontrée en effectuant la puce-qPCR et ChIP-seq pour divers facteurs de transcription, l’ARN polymérase II et covalents histone modifications7.
Cette nouvelle technique est beaucoup plus rapide qu’un protocole a déjà été indiqué8 comprenant depuis longtemps des mesures de digestion de collagénase au cours de laquelle, les changements dans la localisation génomique des facteurs de transcription et les altérations de l’expression des gènes peuvent avoir lieu. La rapidité avec laquelle les noyaux sont isolées et fixe rend la méthode décrite ici particulièrement attractif pour préparer la chromatine qui capte plus fidèlement l’état d’occupation génomique native. En outre, bien que les autres méthodes pour l’extraction de la chromatine isolement ou des protéines de tissu musculaire ont ont été décrit8,9,10 et utilisés pour des expériences de puce-qPCR sur certains gènes, aucun ChIP-seq données a été signalées à les utiliser. La méthode rapportée ici convient pour transcription factor et histone modification ChIP-seq et par conséquent doit être également adaptée aux 3 / 4C ou les applications de capture conformation de la chromatine HiC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un nouveau protocole pour la préparation de la chromatine des muscles squelettiques des souris adultes et montrent que cette chromatine est appropriée pour les expériences de puce détectant les liaison de facteur de transcription et des modifications d’histone covalente dans les noyaux des fibres musculaires. Ce protocole implique plusieurs étapes cruciales. La première est la perturbation de tissus qui peut être effectuée soit par dounce par cisaillement mécanique. Tonte mécanique est plu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tout le personnel de l’installation de séquençage à haut débit IGBMC, membre du consortium « France Génomique » (ANR10-INBS-09-08) et tous les services généraux de l’IGBMC, en particulier le personnel de l’animalerie de l’IGBMC. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le CNRS, l’INSERM, l’AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, les Français l’état des fonds par le biais de l’ANR au titre du programme Investissements d’avenir étiquetés ANR-10-IDEX-0002-02, le Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 et la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. S.J a été appuyée par la Ligue Nationale contre le Cancer et le ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 et V.U par le Ministère de l’enseignement et de la Recherche. ID est une « équipe labellisée » de la Ligue Nationale contre le Cancer.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
