تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات
Summary
ويرد بروتوكول رواية تحضيرا للونين من الماوس الكبار الهيكل العظمى والعضلات تتكيف مع دراسة تنظيم الجينات في ألياف العضلات التي إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين.
Abstract
يصف لنا بروتوكولا كفاءة واستنساخه لإعداد الكروماتين من الماوس الكبار الهيكل العظمى والعضلات، أنسجة بدنيا مقاومة ذات محتوى العالي من البروتينات الهيكلية. العضلات تشريح أطرافهم من الفئران الكبار تتعطل جسديا هوموجينيسيشن الميكانيكية، أو مزيج من تنميق ودونسينج، في مخزن ناقص التوتر قبل التثبيت فورمالدهايد الخلية ليستي. هي تنقية الأنوية الثابتة بزيادة دورات هوموجينيسيشن الميكانيكية أو دونسينج وتصفيات متتابعة لإزالة الحطام خلية. يمكن سونيكاتيد الأنوية المنقي فورا أو في مرحلة لاحقة بعد تجميد. يمكن أن يكون سونيكاتيد الكروماتين كفاءة ويتم الحصول على مناسبة للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين، كما يتضح من التشكيلات الجانبية لعوامل النسخ ورنا بوليميراز الثاني التعديلات التساهمية هيستون. ربط أحداث الكشف عن استخدام الكروماتين التي أعدت بموجب هذا البروتوكول أساسا تلك التي تحدث في نواة الألياف العضلية وعلى الرغم من وجود الكروماتين من السواتل الأخرى المرتبطة بالألياف والخلايا البطانية. ولذلك هذا البروتوكول تكييف لدراسة تنظيم الجينات في الهيكل العظمى والعضلات الماوس الكبار.
Introduction
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) بالإضافة إلى كمية البلمرة المتسلسل (qPCR) وإنتاجية عالية التسلسل (الرقائق-seq) أصبحت أساليب الاختيار لدراسة النسخ وجينيه تنظيم التعبير الجيني في أنسجة مختلفة وأنواع الخلايا1. يسمح هذا الأسلوب على نطاق الجينوم التنميط التعديلات التساهمية الكروماتين، وشغل البديل هيستون والنسخ عامل ملزم2،3.
في حين أداء رقاقة من الخلايا المزروعة بشكل جيد، يبقى رقاقة من أنسجة الثدييات أكثر تحديا. إعداد الكروماتين لرقاقة ينطوي على العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الخلايا والأنسجة. يمكن إعداد الكروماتين من ليساتيس الخلوية للخلايا المزروعة أو تنقية التالية على نويات. في حالة أنسجة الثدييات، تحلل تتسم بالكفاءة، وتثبيت فورمالدهايد، وتنقية نويات ضرورية بغية ضمان استرداد الأمثل الكروماتين. وعلاوة على ذلك، واختيار ما إذا كنت تريد إصلاح الأنوية قبل أو بعد تنقية قد يتحدد تجريبيا. على الرغم من هذه العقبات، تم بنجاح أداء رقاقة من الأنسجة مثل الكبد أو الخصية، أو الدماغ4،،من56. في حالة الهيكل العظمى والعضلات، تعطيل هذه الأنسجة مقاومة جسديا، الذي يسلك محتوى العالي من البروتينات الهيكلية، وعزله عن نويات يشكل تحديا كبيرا. ونظرا لهذه الخصوصية، البروتوكولات الأمثل للأنسجة الأخرى لا تعطي نتائج مرضية لعضلات الهيكل العظمى.
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لعزل الكروماتين الصف شريحة من أنسجة العضلات الهيكلية الماوس ينطوي فعلياً تعطيل الأنسجة، والفورمالديهايد التثبيت، ومن ثم عزل نوى و sonication. وتجلى كفاءة هذا الأسلوب لإعداد الكروماتين مناسبة لشريحة من هذا النسيج أداء رقاقة–قبكر والرقائق-seq لمختلف عوامل النسخ ورنا بوليميراز الثاني التعديلات التساهمية هيستون7.
هذا الأسلوب الجديد أسرع بكثير من بروتوكول سبق الإبلاغ عنها8 تضم طويلة كولاجيناز الهضم الخطوات خلال هذه الفترة، التغييرات في أقلمة الجينوم من عوامل النسخ وقد تجري تعديلات في التعبير الجيني. أن السرعة التي تعزل الأنوية وثابت يجعل الأسلوب الموصوفة هنا جاذبية خاصة لإعداد الكروماتين الذي يلتقط أكثر أمانة الدولة شغله الجينومية الأصلي. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن أساليب أخرى لاستخراج الكروماتين العزلة أو البروتين من أنسجة العضلات وقد تم وصف8،،من910 وتستخدم لإجراء التجارب على رقاقة–قبكر على الجينات المحددة، لا رقاقة-seq تم الإبلاغ عن البيانات باستخدام لهم. الطريقة التي ذكرت هنا وهي مناسبة لتعديل هيستون وعامل النسخ seq رقاقة، ومن ثم ينبغي أن تكون أيضا مناسبة ج 3/4 أو الائتلاف الكروماتين تكيف التقاط التطبيقات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا بروتوكول رواية لإعداد الكروماتين من الماوس الكبار عضلات الهيكل العظمى، وتبين أن هذا الكروماتين مناسبة لإجراء التجارب على رقاقة التي كشف ملزم عامل النسخ والتعديلات التساهمية هستون في الأنوية الألياف العضلية. ويشمل هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اختلال الأنسجة التي ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جميع موظفي مرفق تسلسل الإنتاجية العالية إيجبمك، عضو في اتحاد “فرنسا Génomique” (ANR10-إينبس-09-08) وجميع الخدمات العامة إيجبمك وبخاصة موظفي مرفق الحيوان إيجبمك. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من يزار، في INSERM، فؤاد، الرابطة الوطنية جنيه مكافحة السرطان، الصندوق من خلال وكالة الاستخبارات الوطنية في إطار برنامج يشرف دعفينير المسمى ANR-10-معرض أيدكس-0002-02، لابيكس ANR إينرت-10-معرض أيدكس-0001-02 الدولة الفرنسية ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. أيده S.J جنيه الرابطة الوطنية مكافحة السرطان، و ANR-AR2GR-16-CE11-009-01، و V.U بوزارة التعليم et de la البحوث. هو معرف ‘équipe labellisée’ من الرابطة الوطنية جنيه مكافحة السرطان.
Materials
| T 25 digital ULTRA-TURRAX | T 18 ULTRA-TURRAX | 0009022800 | |
| PMSF | SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL | P7626-25G | |
| Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Protein G Sepharose beads | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-3296 | |
| Proteinase K | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P-2308 | |
| Cell Strainers 70um | Corning BV | 431751 | |
| Cell Strainers 40um | Corning BV | 352340 | |
| Formaldehyde EM grade | Euromedex | 15710-S | |
| Rnase A | Fischer Scientific | 12091039 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | P3803 | |
| BSA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | B4287-25G | |
| yeast tRNA | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | R5636 | |
| Glycogen Blue | AMIBION | AM9516 | |
| Pol II ChIP Antibody | Santa Cruz | SC-9001 | |
| H3K27ac ChIP Antibody | Active Motif | 39133 | |
| Tead4 ChIP Antibody | Aviva Systems Biology | (ARP38276_P050) | |
| IGEPAL | SIGMA-ALDRICH CHIMIE | I-3021 | |
| E220 Focused Ultrasonicator | Covaris E220 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional items | |||
| Scissors | |||
| Loose Dounce | |||
| 15 ml and 50 ml falcon tubes | |||
| 14 ml round bottom tubes | |||
| 1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes | |||
| 70 μm and 40 μm cell strainers (Corning) |
References
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
- Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613 (2014).
- Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530 (2010).
- Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington’s disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
- Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. . Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).
- Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513 (2012).
- Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
- Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
- Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
- . ChIP Analysis Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017)
