Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri
Summary
Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Uranyum kemik fizyolojisi ile müdahale için gösterilmiştir ve de bu metal kemik içinde birikir kuruldu. Ancak, az kemik hücreleri davranışını doğal uranyum etkisi hakkında bilinir. Özellikle, uranyum Osteoklastlar, kemik matrisi rezorpsiyonu için sorumlu hücreler üzerinde etkisini belgelenmemiştir. Bu sorunu araştırmaya, uranyl asetat bir kaynak doğal uranyum ve fare ham 264.7 hücre satırı Osteoklast öncüleri bir model olarak kullanarak yeni bir protokol kurduk. Burada, uranyum sitotoksisite Osteoklast öncüleri üzerinde test etmek ve etkisini osteoclastogenesis ve olgun Osteoklastlar resorbing işlevini değerlendirmek için gerekli bütün testleri ayrıntılı. Koşullar biz geliştirdik, özellikle uranyl içeren kültür medya hazırlanması ve ham 264.7 tohum hücreleri güvenilir ve yüksek üreme sonuçları elde etmek için izin vermek. Ayrıca, Osteoklastlar boyutunu veya resorbed matris yüzdesi gibi çeşitli parametrelerin analiz kolaylaştırmak için yazılım araçları kullanımı optimize.
Introduction
Uranyum doğal olarak meydana gelen radyoaktif element toprak, hava ve su mevcut olduğunu; Bu nedenle, insan ve hayvanlar doğal uranyum besinlerinde maruz kalır. Doğal kaynaklara ek olarak, uranyum antropojenik aktiviteler hangi ortamda onun bereket artar kaynaklanır. Uranyum kimyasal ve radyolojik tehlike teşkil etmektedir. (Bu bir izotopik karışımı içeren %99.27 238U, %0,72 235U ve %0,006 234U) doğal uranyum düşük özel etkinlik (25.103 Bq.g-1) olduğundan, ancak, sağlık üzerinde etkileri atfedilir onun kimyasal toksisitesi.
Ne olursa olsun onun giriş rota (inhalasyon, yenmesi veya dermal pozlama), çoğu uranyum, vücut girerek dışkı ile atılır ve yalnızca küçük bir bölümü sistemik dolaşım ulaşır. Uranyum kan yaklaşık % 67 sırayla böbrekler tarafından süzülür ve vücut idrar 24 h1içinde bırakır. Geri kalan, çoğunlukla böbrek ve kemikler, iki ana hedef organlar uranyum toksisite2,3,4yatırılır. İskelet uranyum uzun süreli saklama2,3,4,5,6birincil site belirlenmiştir çünkü çeşitli çalışmalar keşfetmek için yapılmıştır kemik Fizyoloji7uranyum etkisi.
Ömrü sürekli remodeled mineralized doku kemiktir. Kemik remodeling özel hücre tipleri üzerinde bağlıdır ve çoğunlukla iki aşamadan oluşmaktadır karmaşık bir süreç olduğunu: rezorpsiyonu önceden varolan eski Matrix Osteoklastlar tarafından takip de novo kemik İnşaat tarafından dokusunu tarafından. Osteoklastlar nerede onlar8kemik eklemek rezorpsiyonu sitelere göç öncül hücreleri hematopoetik kökenli füzyonu kaynaklanan büyük multinuclear hücrelerdir. Kendi eki aynı anda onların sitoiskeleti9kapsamlı bir yeniden yapılanma ile oluşur. Bu yeniden yapılanma içine Osteoklast salgılar proton, hidroksiapatit ve proteaz bozulması dahil dağılmasına yol açan kemik yüzeyi arasındaki hücre izole bir bölme kurulması için gereklidir Organik matris. Ortaya çıkan bozulma ürünleri endocytosed, membran alanı kemik yüzeyine ters hücreye aracılığıyla taşınan ve salgılanan, transcytosis10,11adı verilen bir işlem.
Vivo ve in vitro çalışmalar sonuçları uranyum kemik oluşumunu engeller ve numarayı ve etkinlik dokusunu7,12değiştirir gösterir. Buna ek olarak, kemik rezorpsiyonu ve Osteoklastlar uranyum etkileri kötü araştırılmalıdır. Çeşitli in vivo çalışmalarda kemik rezorpsiyonu bir donanım, fare ya da sıçan13,14uranyl nitrat yönetimi sonra bildirdin. Ayrıca, bir epidemiyolojik araştırma uranyum alımı içme suyu ile artış erkekler15kemik rezorpsiyonu işaretleyicisinde serum düzeyinde bir artış ile ilişkili olma eğilimi önerdi. Birlikte ele alındığında, bu bulgular kemik içinde biriken uranyum kemik rezorpsiyonu teşvik verebilecek sonuca yol açtı. Ancak, hücresel mekanizmaları uranyum bu potansiyel etkisi içinde yer alan bir açık soru kalır. Bu nedenle, uranyum kemik hücreleri resorbing davranışı üzerinde etkisini incelemeye karar verdik.
Burada, biz biz kurduk Protokolü tarif karakterize ve doğal uranyum etkileri öncesi Osteoklastlar canlılığı, Osteoklastlar farklılaşma ve resorptive etkinliği ölçmek için. Hangi kolayca ne zaman 4 veya 5 gün boyunca sitokin RANKL huzurunda kültürlü Osteoklastlar içine ayırt edebilir ve hangi klasik incelemek için kullanılır ham 264.7 fare dönüştürülmüş makrofaj hücre satırıyla, burada açıklanan deneyler yapmış Osteoklast16farklılaşma ve işlev. Geliştirilen yordamlar güvenilir, vermek son derece tekrarlanabilir sonuçlar ve are için birincil Osteoklastlar tam olarak uygulanabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı bu metodoloji moleküler mekanizmaları kemik uranyum toksisite dahil daha iyi anlaşılmasını almak için yararlı olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, bu yaklaşım yeni uranyum şelat ajanlar tanımlamak için bir tarama aracı olarak adapte olabileceğini düşünüyorum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bildiğimiz gibi doğal uranyum etkisi kemik hücreleri resorbing çalışmaya yönelik ayrıntılı yönerge açıklanan ilk kez bu. Bu yaklaşım uranyum etkisi kemik fizyolojisi üzerinde daha iyi bir anlayış elde etmek için yararlı olacağını ve uranyum şelatörlerin tarama için ilginç bir yeni bir araç sağlayabilir. Ayrıca, burada açıklanan protokol diğer ağır metaller osteoclatogenesis üzerinde etkisini incelemek için uygulanan olabilir inanıyoruz.
O uranyl complexed …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Chantal Cros yararlı teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.
Bu araştırma gelen hibe tarafından finanse edildi “Komiserliği à l’Energie Atomique et aux enerji alternatifleri” (URANOs – programı enine de Toxicologie du CEA ve CPRR CEA-AREVA) ve ANR üzerinden (uranyum toksisite: biomineralization çok düzeyli yaklaşım «««işlem) kemik, ANR-16-CE34-0003. Bu eser de CNRS ve güzel Sophia Antipolis Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
