Методы анализа последствий природного урана на в пробирке Osteoclastogenesis
Summary
Урана известно влияет на метаболизм костной ткани. Здесь мы представляем протокол, направленный на изучение влияние природного урана воздействия на жизнеспособность, дифференциация и функция остеокласты, клетки отвечает за резорбции кости.
Abstract
Было показано, что уран вмешиваться кости физиологии и хорошо известно, что этот металл накапливается в костях. Однако мало что известно о влиянии природного урана на поведение клеток кости. В частности влияние урана на остеокласты, клетки, ответственные за резорбцию костной матрицы, не документированы. Для расследования этого вопроса, мы создали новый протокол с помощью уранила ацетат как источник природного урана и мышиных RAW 264.7 клеточная линия как модель остеокластов прекурсоров. Здесь мы подробно все анализы, необходимые для тестирования урана цитотоксичность на остеокластов прекурсоров и оценивать его воздействие на osteoclastogenesis и на resorbing функцию зрелых остеокластов. Условия, которые мы разработали, в частности для подготовки уранила содержащих культуры средств массовой информации и для посева RAW 264.7 клетки позволяют получить надежный и высоко репродуктивного результатов. Кроме того мы оптимизировали использования средств программного обеспечения для облегчения анализа различных параметров, таких как размер остеокласты или процент рассосалась матрицы.
Introduction
Уран является естественным радиоактивного элемента, присутствующего в почвы, воздуха и воды; Таким образом животные и люди подвергаются воздействию природного урана в их рационе. В дополнение к естественным источникам уран исходит от антропогенной деятельности, который увеличивает его изобилия в окружающей среде. Уран представляет химической и радиационной опасности. Однако, поскольку природный уран (который является изотопный смесь содержащая 99,27% 238U, 0,72% 235U и 0,006% 234U) низкой удельной активностью (25.103 Bq.g-1), ее воздействия на здоровье объясняются его Химическая токсичность.
Независимо от его запись маршрута (ингаляции, при приеме внутрь или трансдермальном воздействии), большинство урана ввода тела выводится с калом и только небольшая часть достигает кровообращения. Около 67% урана в крови в свою очередь фильтруется почками и покидает тело в моче в течение 24 ч1. Остальные главным образом на хранение в почки и кости, два главных целевых органов урана токсичности2,,34. Потому что скелет был определен как основного сайта урана долгосрочного хранения2,3,4,5,6, было проведено несколько исследований для изучения Влияние урана на кости физиологии7.
Кости является минерализованной ткани, которая непрерывно перестроенный на протяжении всей его жизни. Костного ремоделирования представляет собой сложный процесс, который зависит от типов специализированных клеток и состоит главным образом из двух фаз: рассасывания существующей старой матрицы, остеокласты следуют путем de novo кости строительство остеобластов. Остеокласты являются большие мультипотоковый клетки, обусловленные слияния клеток-предшественников гемопоэтических происхождения которые мигрируют для рассасывания сайты, где они придают кости8. Их привязанность возникает одновременно с обширной реорганизацией их цитоскелета9. Эта реорганизация необходима для создания изолированных отсека между ячейкой и поверхности кости, в которой остеокластов выделяет протонов, что приводит к растворению гидроксиапатита и протеаз, участвующих в деградации органической матрицы. Результате продукты деградации endocytosed, перевозимых через ячейку в области мембранных противоположной поверхности костей и выделяется, этот процесс называется Трансцитоз10,11.
Результаты в vivo и in vitro исследования показывают, что уран препятствует формирования костей и изменяет количество и активность остеобластов7,12. Напротив плохо изучены последствия урана на костную резорбцию и остеокласты. Несколько в vivo исследований сообщали укрепление костной резорбции после отправления уранилнитрата мышей или крыс13,14. Кроме того эпидемиологическое расследование предложил, что увеличение потребления урана через питьевой воды, как правило, быть связано с увеличением уровень в сыворотке крови маркера резорбцию кости в15мужчин. Взятые вместе, эти выводы привели к выводу, что уран, который накапливается в костях, могли бы содействовать резорбции кости. Однако клеточных механизмов, участвующих в этом потенциальное влияние урана остается открытым вопросом. По этой причине мы решили изучить влияние урана на поведение resorbing костных клеток.
Здесь мы описываем протокол, мы создали характеризуют и количественной оценки последствий природного урана на предварительно остеокласты жизнеспособности и дифференциация остеокластов и резорбтивного действия. Эксперименты, описанные здесь было сделано с линией клеток RAW 264.7 мышиных преобразованные макрофагов, которые легко могут дифференцироваться в остеокласты когда культивированный присутствии цитокина RANKL для 4 или 5 дней, и классическом стиле, который используется для изучения остеокластов дифференциации и функции16. Разработанные процедуры являются надежными, дают высокую воспроизводимость результатов и являются полностью применимы к первичной остеокластов. По всем этим причинам мы считаем, что эта методология является полезным для получения лучшего понимания молекулярных механизмов, участвующих в токсичности урана в кости. Кроме того мы считаем, что этот подход может быть адаптирована как инструмент скрининга для выявления новых урана, хелатирующие агенты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Насколько нам известно, это первый раз, что описывается подробная процедура, направленных на изучение влияния природного урана на кости, resorbing клетки. Этот подход будет полезным для достижения лучшего понимания влияния урана на кости физиологии и может обеспечить интересный новый инст…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Шанталь ОЦР для полезной технической помощи.
Это исследование финансировалось за счет субсидий из «меню энергетики комиссариата по атомной энергии et aux альтернативные источники энергии» (URANOs – программа поперечные де Toxicologie du РЭА и CPRR CEA-AREVA) и от НРУ (токсичности урана: многоуровневый подход biomineralization процесс в кости, АНР-16-CE34-0003). Эта работа была также поддержана Университет Ниццы София-Антиполис и CNRS.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
