Methoden voor het analyseren van de gevolgen van natuurlijk Uranium op In Vitro Osteoclastogenesis

Uranium is een natuurlijk voorkomende radioactieve element aanwezig in de bodem, lucht en water; als zodanig, worden dieren en mensen blootgesteld aan natuurlijk uranium in hun dieet. Naast natuurlijke bronnen, is uranium afkomstig uit antropogene activiteiten, dat verhoogt de overvloed in de omgeving. Uranium vormt zowel chemische en radiologische risico’s. Echter, omdat natuurlijk uranium (dat is een isotopische mengsel met 99.27% ²³⁸U 0.72% ²³⁵U, en 0.006% ²³⁴U) heeft een lage specifieke activiteit (25.10³ Bq.g^-1), worden de effecten ervan op de gezondheid toegeschreven aan de chemische toxiciteit.

Wat de vermelding route (inhalatie, inslikken of dermale blootstelling), de meeste van uranium invoeren van het lichaam wordt geëlimineerd met uitwerpselen en slechts een klein gedeelte bereikt de systemische circulatie. Ongeveer 67% van uranium in het bloed is op zijn beurt gefilterd door de nieren en verlaat het lichaam in de urine binnen 24 h¹. De rest wordt meestal gestort in de nieren en de botten, de twee voornaamste doelorganen van uranium toxiciteit,^2,,^3,4. Omdat het skelet heeft aangemerkt als de primaire site van uranium op lange termijn bewaring^2,3,4,5,6, verschillende studies zijn uitgevoerd om te verkennen de effect van uranium op bot fysiologie⁷.

Bot is een gemineraliseerde weefsel dat is voortdurend gerenoveerd tijdens zijn levensduur. Het remodelleren van het bot is een complex proces dat afhankelijk van gespecialiseerde celtypen en bestaat meestal uit twee fasen: resorptie van de reeds bestaande oude matrix door osteoclasten gevolgd door de novo bot bouw van botcellen. Osteoclasten zijn grote multinuclear cellen als gevolg van de fusie van voorlopercellen van hematopoietische oorsprong die naar resorptie sites waar zij hechten migreren aan het bot van⁸. Hun gehechtheid vindt gelijktijdig plaats met een uitgebreide reorganisatie van hun cytoskelet⁹. Deze reorganisatie is vereist voor de totstandbrenging van een geïsoleerd compartiment tussen de cel en het oppervlak van de bot waarin de osteoclast protonen scheidt, wat leidt tot de ontbinding van hydroxyapatiet en proteasen die betrokken zijn bij de afbraak van de organische matrix. De resulterende afbraakproducten worden endocytosed, vervoerd door de cel naar het membraan gebied tegenover het bot oppervlak en uitgescheiden, een proces genaamd transcytosis^10,11.

Resultaten van in vivo en in vitro studies blijkt dat uranium biomineralisatie remt en het nummer en de activiteit van botcellen^{7,12 wijzigt}. In tegenstelling, hebben de effecten van uranium op bot resorptie en osteoclasten slecht onderzocht. Verschillende in vivo studies hebben gemeld een versterking van bot resorptie na toediening van uranyl nitraat naar muizen of ratten^13,14. Een epidemiologisch onderzoek stelde voorts dat de toename van de uranium inname via drinkwater de neiging te worden geassocieerd met een toename van de serum-niveau van een bot resorptie markering in mannen¹⁵. Samen genomen, deze bevindingen leidde tot de conclusie dat uranium, dat zich in bot ophoopt bot resorptie kan bevorderen. De cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij dit potentiële effect van uranium blijven echter een open vraag. Om deze reden besloten hebben we te onderzoeken van het effect van uranium op gedrag van resorbeerbare bot cellen.

Hier beschrijven we het protocol die we hebben vastgesteld te karakteriseren en te kwantificeren van de effecten van natuurlijk uranium over pre osteoclasten levensvatbaarheid en differentiatie van osteoclasten en resorptive activiteit. De hierin beschreven proeven zijn gedaan met de RAW 264.7 lymfkliertest getransformeerde macrofaag cellijn, die gemakkelijk kan onderscheiden in osteoclasten wanneer gekweekt in aanwezigheid van de cytokine RANKL voor 4 of 5 dagen, en die is klassiek gebruikt om te studeren osteoclast differentiatie en functie¹⁶. De procedures ontwikkeld zijn betrouwbaar, zeer reproduceerbare resultaten en zijn volledig van toepassing op primaire osteoclasten geven. Om al deze redenen vinden wij dat deze methode handig is voor het verkrijgen van een beter begrip van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij uranium toxiciteit in bot. Bovendien denken wij dat deze aanpak aangepast als een screening tool worden kan voor het identificeren van nieuwe uranium chelaat agenten.