أساليب لتحليل آثار اليورانيوم الطبيعي في أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر
Summary
ويعرف اليورانيوم لتؤثر على استقلاب العظام. نقدم هنا، بروتوكول يهدف إلى التحقيق أثر التعرض لليورانيوم الطبيعي على استمرارية والتفريق بين وظيفة الآكلة، الخلايا المسؤولة عن ارتشاف العظام.
Abstract
اليورانيوم قد ثبت أن تتداخل مع عظم علم وظائف الأعضاء، وكذلك ثبت أن هذا المعدن يتراكم في العظام. ومع ذلك، يعرف الكثير عن تأثير اليورانيوم الطبيعي على سلوك خلايا العظام. على وجه الخصوص، لم يتم توثيق تأثير اليورانيوم على الآكلة، الخلايا المسؤولة عن ارتشاف مصفوفة العظام،. للتحقيق في هذه القضية، وقد أنشأنا بروتوكول جديد باستخدام خلات اليورانيل كمصدر لليورانيوم الطبيعي وخط الخلية 264.7 الخام مورين كنموذج للسلائف اوستيوكلاست. هنا، نحن بالتفصيل جميع الاختبارات المطلوبة لاختبار سيتوتوكسيسيتي اليورانيوم على السلائف اوستيوكلاست وتقييم أثرها أوستيوكلاستوجينيسيس وعلى وظيفة ريسوربينج الآكلة ناضجة. الشروط التي قمنا بتطوير، ولا سيما لإعداد اليورانيل المحتوية على وسائط الإعلام الثقافة والبذر 264.7 الخام تسمح الخلايا للحصول على نتائج موثوقة وعالية الإنجابية. وعلاوة على ذلك، نحن الأمثل استخدام أدوات البرامج لتيسير تحليل معلمات مختلفة مثل حجم الآكلة أو النسبة المئوية لمصفوفة ريسوربيد.
Introduction
اليورانيوم عنصر مشعة التي تحدث بشكل طبيعي في التربة والهواء والمياه؛ على هذا النحو، تتعرض الحيوانات والبشر لليورانيوم الطبيعي في وجباتهم. بالإضافة إلى المصادر الطبيعية، ينشأ اليورانيوم من الأنشطة البشرية، مما يزيد من الوفرة في البيئة. ويشكل اليورانيوم الإخطار الكيميائية والإشعاعية. ومع ذلك، بسبب انخفاض نشاط معين (Bq.g3 25.10-1) اليورانيوم الطبيعي (وهو خليط النظائر المشعة التي تحتوي على 99.27% 238U و 0.72 في المائة 235U 2340.006% U)، آثار تغير المناخ على الصحة يعزى إلى ما سمية المواد الكيميائية.
أيا كان المسار الإدخال الخاص به (الاستنشاق أو الابتلاع أو التعرض الجلدي)، ومعظم تدخل الجسم يتم التخلص من اليورانيوم مع البراز وسوى جزء صغير يصل إلى الدوران الجهازي. حوالي 67 في المائة يورانيوم في الدم بدوره يتم تصفية بواسطة الكليتين، وتترك الجسم في البول خلال 24 ساعة1. الباقي معظمها يترسب في الكلي والعظام، والجهازين الهدف الرئيسي لليورانيوم سمية2،،من34. لأنه تم التعرف على هيكل عظمى كموقع أساسي لليورانيوم طويلة الأجل الاحتفاظ2،3،4،،من56، أجريت عدة دراسات لاستكشاف تأثير اليورانيوم على عظم علم وظائف الأعضاء7.
العظم هو نسيج التعدينية التي يتم تشكيلها بشكل مستمر طوال حياتها. إعادة عرض العظام هو عملية معقدة تعتمد على أنواع الخلايا المتخصصة، وتتألف في معظمها من مرحلتين: ارتشاف المصفوفة القديمة الموجودة مسبقاً بالأكلة يتبعها دي نوفو العظام البناء بواسطة خلايا الاوستيوبلاستس. الآكلة هي خلايا مولتينوكليار الكبيرة الناتجة عن انصهار الخلايا السليفة الأصلية المكونة للدم التي تهاجر إلى مواقع ارتشاف حيث يعلقونها على العظام8. تمسكهم يحدث في نفس الوقت إعادة تنظيم واسعة النطاق لما سيتوسكيليتون9. إعادة التنظيم هذه المطلوب لإنشاء حجرة منعزلة بين الخلية والسطح العظام التي تفرز اوستيوكلاست البروتونات، مما يؤدي إلى تفكك هيدروكسيباتيت، والبروتياز المتورطين في التدهور مصفوفة العضوية. منتجات التحلل الناتجة المبتلعة، تنقل عبر الخلية إلى منطقة الغشاء مقابل سطح العظام ويفرز، عملية تسمى ترانسسيتوسيس10،11.
تبين نتائج الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر أن اليورانيوم يحول دون تكوين العظام، ويغير العدد ونشاط خلايا الاوستيوبلاستس7،12. وفي المقابل، تم استكشاف آثار اليورانيوم على ارتشاف العظم والأكلة سيئة. وأفادت عدة في فيفو الدراسات زيادة ارتشاف العظم بعد إدارة نترات اليورانيل للفئران أو الجرذان13،14. وعلاوة على ذلك، اقترح التحريات وبائية أن الزيادة في كمية اليورانيوم عن طريق مياه الشرب تميل إلى أن تكون مرتبطة بزيادة في مستوى المصل من علامة ارتشاف العظام في الرجل15. أخذت معا، أدت هذه النتائج إلى الاستنتاج بأن اليورانيوم الذي يتراكم في العظام يمكن أن تعزز ارتشاف العظام. ومع ذلك، تظل الآليات الخلوية التي تشارك في هذا الأثر المحتمل لليورانيوم مسألة مفتوحة. لهذا السبب، قررنا أن دراسة تأثير اليورانيوم على سلوك ريسوربينج خلايا العظام.
هنا، يمكننا وصف البروتوكول قد أنشأنا لوصف وقياس آثار اليورانيوم الطبيعي على الآكلة ما قبل الجدوى والتمايز الآكلة والنشاط ريسوربتيفي. وأجريت التجارب الموضحة هنا مع خط الخلية بلعم تحول مورين 264.7 الخام، الذي يمكن أن يسهل تفرق في الآكلة عند مثقف حضور سيتوكين رانكل لمدة 4 أو 5 أيام، والذي يستخدم تقليديا للدراسة اوستيوكلاست التمايز والدالة16. الإجراءات التي وضعت موثوقة، وتعطي النتائج استنساخه بدرجة عالية، وهي تنطبق تماما على الآكلة الرئيسية. لكل هذه الأسباب، ونحن نعتقد أن هذه المنهجية مفيدة للحصول على فهم أفضل للآليات الجزيئية التي تشارك في سمية اليورانيوم في العظام. وعلاوة على ذلك، نعتقد أن هذا النهج يمكن أن تكيف كأداة فحص لتحديد جديد اليورانيوم خالب وكلاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبقدر ما نعلم، هذا هو المرة الأولى التي يرد وصف لإجراءات مفصلة تهدف إلى دراسة تأثير اليورانيوم الطبيعي على عظم ريسوربينج الخلايا. هذا النهج سوف تكون مفيدة لتحقيق فهم أفضل لتأثير اليورانيوم على عظم علم وظائف الأعضاء وقد توفر أداة جديدة مثيرة لاهتمام لفحص اليورانيوم تشيلاتورس. وعلاوة على ذ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر Cros شانتال للمساعدة التقنية مفيدة.
تم تمويل هذا البحث من المنح المقدمة من “à مفوضية الطاقة الذرية et aux بدائل الطاقات” (أورانوس-دو توكسيكولوجي دي مستعرضاً برنامج سيا وكبرر سيا-شركة أريفا)، ومن وكالة الاستخبارات الوطنية (سمية من اليورانيوم: نهج متعدد المستويات من بيومينيراليزيشن عملية في العظم، ووكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE34-0003). وأيد هذا العمل أيضا جامعة نيس صوفيا انتيبوليس، ويزأر.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
References
- Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).
- Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).
- Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).
- Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).
- Leggett, R. W. Basis for the ICRP’s age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).
- Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).
- Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).
- Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).
- Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
- Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276 (5310), 266-269 (1997).
- Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276 (5310), 270-273 (1997).
- Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).
- Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).
- Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).
- Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).
- Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
- Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).
- Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).
- Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).
- Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).
- Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).
- Studzinski, G. P. . Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).
- Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).
- Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).
