Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo
Summary
Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l’interazione microbica.
Abstract
Dimostriamo un metodo utilizzando Caenorhabditis elegans come un host di modello per studiare l’interazione microbica. I microbi vengono introdotti attraverso la dieta rendendo l’intestino il luogo primario per la malattia. L’intestino del nematode strutturalmente e funzionalmente imita gli intestini dei mammiferi ed è trasparente che lo rende suscettibile di uno studio al microscopio della colonizzazione. Qui vi mostriamo che gli agenti patogeni possono causare la malattia e la morte. Siamo in grado di identificare microbiche mutanti che mostrano alterata virulenza. Sua risposta innata conservata a stress biotici rende c. elegans un eccellente sistema per sondare le sfaccettature delle interazioni immune innata ospite. Indichiamo che padroni di casa con le mutazioni nel gene raddoppiano ossidasi non può produrre le specie reattive dell’ossigeno e sono in grado di resistere insulto microbico. Noi dimostrare ulteriormente la versatilità del dosaggio sopravvivenza presentato mostrando che può essere utilizzato per studiare gli effetti degli inibitori della crescita microbica. Questo dosaggio può anche essere usato per scoprire i fattori di virulenza fungine come bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antifungini, nonché a fornire l’opportunità di scoprire ulteriori interazioni ospite-microbo. Il design di questo test si presta bene a throughput elevato schermi intero genoma, mentre la possibilità di crioconservare worm per un utilizzo futuro lo rende un modello animale intero conveniente e attraente per studiare.
Introduction
C. elegans è stato utilizzato come organismo modello potente per più di 50 anni. Nel 1960, biologo sudafricano Sydney Brenner ha sperimentato l’uso di c. elegans per studiare lo sviluppo neuronale, aprendo la strada a una lunga stirpe di scienziati per studiare vari aspetti della biologia delle cellule e animali nei nematodi. Questo lignaggio include vincitori del premio Nobel Craig Mello e Andrew Fire per il loro lavoro di RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro per lo sviluppo dell’organo e apoptosi2,3,4e Martin Chalfie per il suo lavoro sulla proteina fluorescente verde5. Anche se questo organismo di modello è stato tradizionalmente usato per studiare la biologia molecolare e dello sviluppo, negli ultimi 15 anni, i ricercatori hanno cominciato ad usare c. elegans per studiare la biologia di vari agenti patogeni umani, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericae Serratia marcescens6,7,8,9,10. Questi studi hanno rivelato che molti dei meccanismi coinvolti nell’interazione umano-patogeno sono conservati in nematodi, ma anche che ci sono alcuni meccanismi di immunità che sono unici per questo modello organismo11,12. In natura, c. elegans incontra una varietà di minacce da ingerito agenti patogeni presenti nel terreno e questo ha fornito una forte pressione selettiva per evolvere e mantenere un sofisticato sistema immunitario innato nel suo lume intestinale. Molti dei geni e meccanismi coinvolti nella protezione del lume intestinale sono orchestrati da elementi altamente conservata che esistono anche in più alti mammiferi11,13. C. elegans rappresenta quindi un ottimo modello per studiare gli agenti patogeni gastrointestinali come Salmonella enterica14, Shigella boydii15o vibrione del colera16.
Qui si evidenzia la notevole versatilità di c. elegans come un host di modello per lo studio di agenti infettivi quali c. albicans. C. elegans come un host di modello consente di screening su vasta scala per la virulenza che è meno costoso e che richiede tempo che un modello del topo, che è comunemente usato per studiare la candidosi42.
In questo studio, mostriamo che questo modello e l’analisi di sopravvivenza manuale può essere utilizzati in modo affidabile per lo studio di host innata gli effettori immunitari importanti per contrastare le infezioni, fattori determinanti di agente patogeno che guidano la virulenza, e composti farmacologici che possono intervenire nella patogenesi. Dissimile da saggi descritti in precedenza, questo metodo fornisce un mezzo per studiare l’esposizione ad un agente patogeno per tutta la durata dell’animale, dalla fase larvale di età adulta, piuttosto che solo nell’età adulta a morte43,44. In sintesi, il nostro c. elegans – modello c. albicans è uno strumento potente e versatile che può essere utilizzato non solo per studiare le basi genetiche che guidano l’infezione e l’immunità, ma anche di identificare nuovi composti per intervento terapeutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi per analizzante infezione di c. elegans e sopravvivenza sopra esposizione in vita a albicans del c. che abbiamo descritto possono essere modificati per testare un altro agente patogeno. Colture liquide di un altro batteri o funghi possono essere formate e alimentate al c. elegans in modo simile. Inoltre, possono essere dosate seriale infezioni prima esponendo la larva di un agente patogeno come descritto, e quindi trasferire gli animali su un nuovo piatto contenente un agente patogeno …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata eseguita presso e supportata da Worcester Polytechnic Institute.
Materials
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
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