Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Достижения в технологии секвенирование нового поколения привели к новый ландшафт для изучения биологических систем и болезни человека. Это позволило большое количество измерений генома, транскриптом, протеом, метаболом и других молекулярных систем станет ощутимым. Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее чувствительных методов в аналитической химии, и его применение в протеомике быстро расширилась после секвенирования генома человека. В области протеомики за последние несколько лет были достигнуты крупные технические достижения в основе MS количественного анализа, включая Изобарический маркировки и мультиплексирования возможности в сочетании с обширной жидкостной хроматографии, помимо инструментария авансы, позволяя быстрее, более точные измерения с меньше материала образца требуется. Количественные протеомике стали основной подход для профилирования десятки тысяч белков и Посттрансляционная модификаций в весьма сложных биологических образцов^{1,2,3,4 , 5 , 6}.

Мультиплексированных Изобарический обозначая методы, такие как Изобарический тег для относительной и абсолютной количественный (например, iTRAQ) и тандем массового тег (ТМТ) MS значительно улучшили образца пропускной способности и увеличил количество образцов, которые могут быть проанализированы в отдельном эксперимент^1,6,,78. Наряду с другими на основе MS количественный методы например метка бесплатно количественный и стабильных изотопов, маркировки с аминокислоты в культуре клеток (например, SILAC), потенциал этих методов протеомики поле является значительным^{9 ,10,11}. Например метод ТМТ позволяет 10 образцы протеина, чтобы быть проанализированы вместе в 1 эксперимент с использованием 10-plex реагентов. Эти структурно идентичны TMT теги имеют той же общей массы, но тяжелые изотопы распределяются дифференцировано на атомы углерода и азота, обусловило уникальный репортер Ион во время МС/МС фрагментации каждого тега, тем самым позволяя относительной количественный между 10 образцов. TMT стратегия обычно применяется для изучения биологических пути, прогрессирования заболевания и клеточных процессов^12,,1314.

Значительные технические усовершенствования улучшили жидкостной хроматографии (LC)-MS/MS систем, как с точки зрения LC цветоделение и MS параметры, чтобы максимизировать идентификации белок без ущерба для точности количественный. Разделение первом измерении пептидов путем разделения технику с высоким ортогональности для второго измерения имеет решающее значение в этом типе метода протеомики ружье для достижения максимальных результатов²⁰. Высоком рН обратная фаза жидкостной хроматографии (RPLC) обеспечивает лучшую производительность, чем обычных сильных катионообмен хроматографии²⁰. При высоком рН RPLC сочетается с второго измерения низкого pH RPLC, аналитический динамический диапазон и белка охват улучшаются, результате способность определить основную часть выраженных белков при выполнении всего протеома анализы^{15 ,16,17,18}. Другие технические достижения включают в себя мелкие частицы C18 (1.9 мкм) и продлил длинный столбец (~ 1 м)¹⁹. Кроме того другие заметные улучшения включают в себя новые версии масс-спектрометров с быстрого сканирования ставки, улучшена чувствительность и резолюции²⁰и сложные биоинформатики трубопроводов для интеллектуального анализа данных MS²¹.

Здесь мы описываем подробный протокол, который включает в себя самые последние методики с изменениями для повышения чувствительности и пропускную способность, сосредоточив внимание на механизмы контроля качества на протяжении всего эксперимента. Протокол включает извлечения белков и пищеварение, TMT 10-plex маркировки, базовых pH и рН RPLC фракционирования, с высоким разрешением MS обнаружения и обработки данных MS (рис. 1). Кроме того мы осуществляем несколько этапов контроля качества для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Этот подробный протокол призван помочь исследователям новые на местах регулярно выявлять и точно quantitate тысячи белков от lysate или ткани.