Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Progrès de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont conduit à un nouveau paysage pour l’étude des systèmes biologiques et la maladie humaine. Cela a permis à un grand nombre de mesures du génome, transcriptome, protéome, métabolome et autres systèmes moléculaires pour devenir tangible. Spectrométrie de masse (MS) est une des méthodes plus sensibles en chimie analytique, et son application en protéomique a rapidement élargi après le séquençage du génome humain. Dans le domaine de la protéomique, ces dernières années ont abouti à des avancées techniques majeures dans basées sur des analyses quantitatives, y compris les isobares de marquage et de multiplexage capacité combinée à une vaste chromatographie en phase liquide, en plus de l’instrumentation avances, permettant des mesures plus précises et plus rapides avec moins de matériau échantillon requis. Protéomique quantitative est devenus une approche grand public pour le profilage des dizaines de milliers de protéines et de modifications post-traductionnelles dans des échantillons biologiques extrêmement complexes^{1,2,3,4 , 5 , 6}.

Multiplexé isobares étiquetage méthodes telles que tag isobarique pour quantification relative et absolue (par exemple, iTRAQ) et tag de masse en tandem (TMT) MS ont grandement amélioré le débit de l’échantillon et a augmenté le nombre d’échantillons qui peuvent être analysées dans une seule expérience^1,6,7,8. Ainsi que d’autres méthodes de quantification basée sur MS, comme dosage exempte d’étiquette et les isotopes stables d’étiquetage avec des acides aminés en culture cellulaire (c.-à-d., SILAC), le potentiel de ces techniques dans la protéomique champ est considérable^{9 ,10,11}. Par exemple, la méthode TMT autorise 10 échantillons de protéines pour être analysés dans le 1 expérience à l’aide de réactifs 10-plex. Ces balises TMT structurellement identiques ont la même masse globale, mais les isotopes lourds sont répartis différemment sur des atomes de carbone ou d’azote, résultant en un ion unique journaliste pendant la fragmentation MS/MS de chaque étiquette, ce qui permet la quantification relative entre les 10 échantillons. La stratégie TMT est systématiquement appliquée afin d’étudier les processus cellulaires^12,13,14voies biologiques et progression de la maladie.

Importantes améliorations techniques ont amélioré les systèmes de chromatographie liquide (LC)-MS/MS, tant au niveau des séparations LC et les paramètres de MS, afin d’optimiser l’identification des protéines sans sacrifier la précision de dosage. Première dimension séparation des peptides par une technique de séparation avec l’orthogonalité élevée à la deuxième dimension est essentielle dans ce type de méthode protéomique fusil pour atteindre un résultat maximum²⁰. Chromatographie liquide en phase inversée pH élevé (RPLC) offre de meilleures performances que ne le fait de chromatographie échangeuse de cations forts classiques²⁰. RPLC pH élevé est associé à une deuxième dimension du RPLC pH faible, tant analytique gamme dynamique et la couverture de protéine sont améliorées, ayant pour résultat la capacité d’identifier la majeure partie des protéines exprimées lors de l’exécution d’ensemble-proteome analyses^{15 ,16,17,18}. D’autres avancées techniques comprennent les petites particules de C18 (1,9 µm) et étendu longue colonne (~ 1 m)¹⁹. En outre, autres améliorations notables incluent les nouvelles versions de spectromètres de masse avec taux de balayage rapide, amélioration de la sensibilité et résolution²⁰et les pipelines de bioinformatique sophistiqué pour MS données minières²¹.

Nous décrivons ici un protocole détaillé qui intègre les plus récentes méthodologies avec modifications afin d’améliorer la sensibilité et le débit, tout en se concentrant sur les mécanismes de contrôle de la qualité tout au long de l’expérience. Le protocole prévoit l’extraction de protéine et digestion, TMT 10-plex étiquetage, pH basique et fractionnement RPLC pH acide, haute résolution détection MS et MS informatique (Figure 1). En outre, nous mettre en œuvre plusieurs mesures de contrôle de la qualité de diagnostic et d’évaluation variation expérimentale. Ce protocole détaillé est destiné à aider les nouveaux chercheurs sur le terrain systématiquement identifier et à quantifier avec précision des milliers de protéines d’un lysat ou tissu.