細胞内タンパク質間相互作用を研究するビオチン化セル透過ペプチド

実験のすべてのプロシージャは、サラマンカ大学で行われました。 1. セル 手順を開始する前に 2 日間は、実験の日に合流する必要な密度で細胞をプレートします。フラスコのセル板をプレートします。ただし、蛋白質の抽出は、プレートから容易になります。準備 78 cm2の少なくとも 4 枚または 1 つの実験につき条件 150 cm2のフラスコ 2 必ず結果が一致すると便利です。 本研究では、150 cm2, 2% 1 %n2、B27 20 ng/mL EGF および B-FGF ポラードら22のとおり補足 RHB A 幹細胞培地中で培養のフラスコを 4 で人間 G166 GSCs をプレートします。合流点に達したときのプロセス。たとえば、5 x 106 G166 セルは、150 cm2フラスコでメッキされた、2 日目のプレートが処理されました。 2. ビオチン CPPs 30 8200 x gで凍結乾燥させたビオチン Cpp (BCPPs) を含むバイアルを回転 s、蓋に残った粉のいくつかを避けるために。コントロール BCPP 発見相互作用、ターゲット シーケンスの特定であることを確認します。本研究では制御 BCPP TAT ビオチン (TAT B) あり治療 BCPP が TAT cx 43266-283Bビオチンに TAT スクランブルまたは変異する溶かされたフラグメント結合など、他のコントロールを使用できます。 原液製造によって示されるに対応する培地の BCPPs を溶解します。例えば、2 mg/mL の原液を取得する BCPP GSCs を治療するためには 1 つのバイアル、BCPP の 1 mg を含有する GSC 培養液 0.5 mL を追加します。渦、ペプチドは分解もかどうかを確認します。 3. チューブ 注: は、1 つのセクション 7 で必要な条件、少なくとも 12 1.5 mL チューブを準備します。 1 つの条件最初 3 管をマークします。6.4 手順で取得した細胞溶解液の容量をがあります。 3 チューブ 1 つの条件で A をマークします。これらのチューブでお越しの際にも溶解し、細胞溶解液を回転ステップ 7.2 後に得られる最初の清。 3 チューブ 1 つの条件で B をマークします。これらのチューブでお越しの際にも最初の培養上清の小さい因数。これらの lysates はステップ 7.3 の西部のしみのサンプルとなります。 3 チューブ 1 つの条件で C をマークします。これらのチューブでお越しの際にも NeutrAvidin、7.7 のステップとプルダウン後に得られた上清。注: これは西部のしみは蛋白質、蛋白質引っ張られたないまたはプロシージャのいくつかのステップで失われた意味の信号を示さなかった場合に重要です。状況なら、タンパク質をプルダウンするプロセスを繰り返します。 4. 細胞治療、BCPPs 培養液を吸い出しなさい。 インキュベーション時間に従って媒体の最小の可能なボリュームの BCPPs の孵化に必要な新鮮な媒体の対応するボリュームに置き換えます。それは非常に重要なこといずれの場合も、媒体完全に全体の表面を覆うプレート/フラスコ、セルが 30 分孵化のため 150 cm2あたり例えば、6 mL を乾燥しないでください。 効果的であることが証明されている濃度に到達する細胞培養に BCPP の原液量を追加します。この研究 50 μ M TAT cx 43266 283で B は GSC の拡散を減らすために証明されています。 したがって、2 mg/ml の TAT cx 43266 28392.8 μ L を追加 -B (MW = 3723.34 g/mol) の培地、最終濃度が 50 μ M TAT cx 43266 283の mL あたり B追加するボリュームの制御ペプチドの異なる場合は、同じ最終巻まで培養液中で完了します。例えば、49.1 μ L TAT B (MW = 1914.31 g/mol) 43.7 μ L GSC メディア プラス、最終濃度が 50 μ M の培養液中の mL あたり追加された TAT B BCPP とその細胞内のパートナー間の相互作用が起こることを確認する 30 分の CO2を 37 ° C、5% でインキュベーターでセルを配置します。相互作用時間がかかります、長い時間インキュベートまたは時間コースから成っていた実験ケースで時間を調整します。さらに、興味の相互作用を推進または刺激の異なる細胞内シグナル伝達経路によって阻止できます。 5. バッファーおよびソリューション。 PBS pH 7.4: 136 mM の NaCl; を準備します。2.7 mM KCl;7.8 mM Na2HPO4·2H2O;1.7 mM KH2PO4。 タンパク質の換散バッファーの準備: 20 mM トリス-HCl (pH 8.0)、137 mM NaCl、1 %igepal、前を使用して、次の追加: 1/100 (v/v) プロテアーゼ阻害剤カクテル、1 mM フッ化ナトリウム 1 mM Phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) と 0.1 mM ナトリウム バナジン。 塩化物イオンとバッファーを準備: (4 x: 0.18 M トリス-HCl pH 6.8; 5 M グリセロール; 3.7 %sds (p/v); 0.6 M β-メルカプトエタノールや 9 mM DTT; 0.04% (v/v) ブロモフェノール ブルー (BB))。 6 蛋白質の抽出 注意: 蛋白質の抽出は、上記20,23として実施されました。4 ° C でプロシージャのこの全体のセクションを運ぶ 完全に培養液を吸い出しなさい。 洗浄 3 x 10 mL の冷たいリン酸は細胞の剥離を避けるために非常に慎重に生理食塩水 (PBS) 150 cm2あたりをバッファーしました。 細胞ライセートを得るためには、150 cm2あたりの換散バッファーの 3 mL を加えるし、細胞スクレーパーを使用して、徹底的に表面をこすり。プレート/フラスコを約 45 度の傾斜に対応するチューブにセル lysates を収集するために容易になります。 3 1.5 mL チューブにチューブごとライセートの携帯の 1 mL を注ぐ。これらの管は、条件とレプリケートする 3.1 の手順で示されるようにマークされます。 7. プルダウン 4 ° C で 10 分間 11,000 x gで 1.5 mL チューブを遠心分離します。 培養上清を新しいチューブ (A) に転送します。 異なるチューブ (B)、すなわち 50 μ L 管ごとに 1 つの条件この上清の因数を取る。4 x Laemmli バッファー (溶解液を 50 μ l 添加の 16.6 μ L) を追加し、-20 ° C の凍結これらの lysates をいつものように西部のしみのサンプルとなります。 非常によく、穏やかな揺れで NeutrAvidin アガロースを均質化します。ピペット チップの径、ビーズのピペッティングを向上させるためのヒントをカットします。細胞ライセート (A) 管内の mL あたり NeutrAvidin Agarose の 50 μ L を追加します。 NeutrAvidin 細胞内相手にバインドされている BCPPs との対話を許可するように非常に穏やかな揺れで一晩 4 ° C で孵化させなさい。 NeutrAvidin のタンパク質と複合体を収集するために 4 ° C で 1 分 3,000 × gで遠心分離機します。 慎重に培養上清を削除し、クリーン チューブ (C) に転送します。プルダウンが正常でない場合、それらを使用するようにします。 洗濯の手順: ペレット (A 管) に新鮮な換散バッファーを追加、逆転によって再懸濁します、7.6 の手順を繰り返します)、7.7) 5 回以上の。これらの培養上清を破棄することができます。 培養上清を削除し、目的の最終巻 (150 cm2フラスコ コンフルエントの細胞から得られたペレット 1.5 mL チューブあたり 40 μ L) に 2 x Laemmli バッファーを追加します。 タンパク質と 30 の遠心力の相互作用を分離するに 5 分間 100 ° C で溶出 NeutrAvidin ビーズをペレットに 8,200 x gで s。 キャピラリーのヒント新しいチューブ (D) を解離の蛋白質を含んでいる、培養上清を取る。繰り返し溶出のステップが必要な場合に、ビーズを保つことができます。注: 清 (D 管) は西部のしみに読み込まれるまたは-20 ° C の凍結する準備が整いました 8 西部のしみ 注意: は、上記24として行われた西部にしみが付くこと。 各サンプル Midi 細胞電気泳動システムで Bis-トリス (4-12%) midigels レーンあたりの同等のボリュームを読み込みます。 ウエスタンブロッティング蛋白質は硝酸セルロース正規スタックに乾燥しみが付くシステムを使用して。 10% の膜を染色 Ponceau 10 分。 TTBS の 5 mL と 3 x 5 分の膜を洗浄します。 チューブまたは小さなボックスで穏やかな揺れで 1 時間 TTBS に 7% のミルクで膜をブロックします。使用量は膜をカバーするのに十分、彼ら乾燥しないでください、すなわち全体の midi 膜あたり 40 mL を確認します。 TTBS の 5 mL と 3 x 5 分を洗ってください。 穏やかな揺れで興味の蛋白質に対して一次抗体と 4 ° C で一晩インキュベートします。 TTBS の 5 mL と 3 x 5 分を洗ってください。 膜、特派員ペルオキシダーゼ標識二次抗体と TTBS に 1 時間室温で孵化させなさい。 TTBS の 5 mL と 3 x 5 分を洗ってください。 化学ルミネセンスの基板と化学発光系の開発します。 9. 問題解決 開発後、西部のしみのすべての蛋白質のための信号を示したサンプルのいずれか場合、Ponceau を確認します。注: Ponceau で膜に未定義表示する必要があります、車線に沿って多数のバンドが読み込まれます。バンドは非常に顕著ではない、読み込まれる蛋白質の量が十分ではないか、転院が正しく行っています。西部のしみを繰り返し検討してください。 すべてで任意の車線で Ponceau 膜の汚れがない場合は、(C) 管のステップ 7.4 から全体の手順を繰り返します。 西部のしみを開発した後、タンパク質の信号は非常に弱いが、Ponceau 示したタンパク質、再び一次抗体と膜が、長い時間孵化させなさい。信号は弱いがまだの場合は、室温で再びインキュベートします。 10 この記事でその他の技術の使用 BCPPs の 4% のパラホルムアルデヒド (cm2あたり 0.2 mL) 20 分のセルを修正します。 PBS (cm2あたり 0.2 mL) 3 x 5 分を洗ってください。 4 ° C で一晩興味の蛋白質に対して製造元の指示された濃度で抗体溶液で希釈した対応する抗体 (cm2あたり少なくとも 0.15 mL) を適用します。 蛍光標識二次抗体 (cm2あたり 0.15 mL) 室温で 2 時間で孵化させなさい。 興味の蛋白質に対して他の抗体と手順 10.1.2-10.1.4 を繰り返します。別の一次抗体や二次抗体のための同じ波長同時に同じ種を使用しないように注意してください。 Antifade 試薬 (cm2あたり 0.005 mL) を使用してセルをマウントします。 デジタル カメラに接続されている蛍光顕微鏡で分析します。 MTT の試金 37 ° c 24 ウェルプレートでの細胞を培養します。 細胞培養液 0.5 mg/mL MTT を含む cm2あたり 0.15 ml 75 分間暗闇の中で孵化させなさい。 培地を吸引し、ジメチルスルホキシド (cm2あたり 0.25 mL) 穏やかな揺れで暗闇の中で 10 分間細胞をインキュベートします。 570 の波長で吸光度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。