חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

כל ההליכים ניסיוני בוצעו על הכתב לאוניברסיטת סלמנקה לבחינה. 1. תאים יומיים לפני תחילת ההליך, צלחת התאים-צפיפות נדרש להיות confluent היום של הניסוי. צלחת התאים מבחנות או צלחות. עם זאת, החילוץ חלבון יהיה קל יותר של צלחות. זה נוח להכין לפחות ארבע פלטות של 78 ס מ2 או 2 בקבוקונים של 150 ס”מ2 לכל תנאי לכל ניסוי, כדי להיות בטוח כי התוצאות אינן עקביות. במחקר זה, צלחת GSCs G166 האנושי ב- 4 מבחנות של 150 ס מ2, תרבותי במדיום תאי גזע RHB-A בתוספת 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF ו b-FGF כפי שתואר על ידי פולארד et al.22. תהליך כאשר הנהרות הושג. למשל, כאשר 5 x 106 G166 תאים מצופים בבקבוקון2 150 ס מ, הם עובדו 2 ימים לאחר ציפוי. 2. Biotinylated CPPs לסובב את הבקבוקונים המכיל את biotinylated lyophilized CPPs (BCPPs) ב 8200 x g ב-30 s, כדי להימנע כמה האבקה שנותרה על המכסה. כוללות פקד BCPP כדי לוודא האינטראקציות נמצאו הספציפיים של הרצף היעד. במחקר זה, הפקד BCPP היה טאט-ביוטין (TAT-B), הטיפול BCPP טאט-Cx43266-283- בי פקדים אחרים יכול לשמש, כגון ערבות שברי מאוחה מקושקשות או מוטציה TAT ביוטין. להמיס את BCPPs במדיום תרבות המתאימים לפתרון מניות שציין היצרן; למשל, כדי להשיג פתרון מניות של 2 מ”ג/מ”ל BCPP לטיפול GSCs להוסיף 0.5 מיליליטר GSC תרבות בינוני בקבוקון אחד המכיל 1 מ ג של BCPP. מערבולת ולוודא פפטיד טוב התפרקה. 3. צינורות הערה: להכין לפחות 12 1.5 mL צינורות לכל תנאי הנדרש בסעיף 7. סמן את צינורות הראשון 3 לכל תנאי. יהיה להם את הנפח הכולל של lysates הסלולר שהושג בשלב 6.4. סימון A 3 צינורות לכל תנאי. הצינורות האלה יש את supernatants הראשון שהושג לאחר lysing, ספינינג lysates הסלולר, צעד 7.2. סימון a B 3 צינורות לכל תנאי. צינורות אלה יהיו aliquot קטן של supernatants הראשון. Lysates אלה ישמש הדגימות תספיג בשלב 7.3. סמן סי 3 צינורות לכל תנאי. הצינורות האלה יש את supernatants שהושג לאחר נפתחים עם NeutrAvidin, שלב 7.7.הערה: זה חשוב במקרה תספיג הראה שאין אותות עבור חלבונים, כלומר החלבונים היו לא הוריד או אבדו בשלב כלשהו של ההליך. אם זה היה המצב, חזור על התהליך כדי להוריד את החלבונים. 4. הסלולר טיפול עם BCPPs האחות המדיום תרבות. החלף את האחסון המתאימים בינוני טריים נדרשים דגירה של BCPPs אפשרי בהיקף בינוני לפי הזמנים הדגירה הקטן ביותר. חשוב מאוד כי בכל מקרה, המדיום מכסה לחלוטין פני הבקבוק/הצלחת כך התאים לא יתייבש, למשל, 6 מ לכל 150 ס”מ2 עבור דגירה 30 דקות. הוסף את עוצמת הקול של הפתרון מניות של BCPP תרביות תאים כדי להגיע ריכוז זה הוכח כיעיל. בזה מחקר 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- B הוכח כדי לצמצם את התפשטות GSC. לכן, הוספת 92.8 µL של 2 מ”ג/מ”ל טאט-Cx43266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) לכל מיליליטר תרבות בינוני בריכוז הסופי של 50 מיקרומטר טאט-Cx43266-283- בי אם אמצעי האחסון שיתווספו שונה עבור פקד פפטידים, להשלים עם תרבות בינוני עד גמר באותו אמצעי אחסון. למשל, 49.1 µL טאט-B (MW = 1914.31 g/mol) ובנוסף 43.7 µL GSC בינוני נוספו לכל מיליליטר תרבות בינוני בריכוז הסופי של 50 מיקרומטר טאט-בי מקם את התאים בחממה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות לוודא מתקיימים יחסי גומלין של BCPP ושותפיה תאיים. אם האינטראקציה לוקח יותר זמן, דגירה משכי זמן ארוכים יותר או להתאים פעמים במקרה הניסוי כללה זמן-קורס. בנוסף, האינטראקציה עניין יכול להיות קידום או למניעה על ידי גירוי שונים תאיים איתות המסלולים. 5. מאגרי ופתרונות. להכין PBS pH 7.4: 136 מ”מ NaCl; 2.7 מ”מ אשלגן כלורי; 7.8 מ מ נה2HPO4·2H2O; 1.7 מ”מ ח’2PO4. להכין מאגר פירוק חלבון: 20 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 137 מ מ NaCl, 1% IGEPAL, לפני השימוש, להוסיף את הדברים הבאים: 1/100 (v/v) פרוטאז מעכב קוקטייל, 1 מ”מ נתרן פלואוריד, 1 מ Phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF), orthovanadate נתרן 0.1 מ מ. הכנת מאגר Laemmli: (4 x: מ’ טריס-HCl 0.18 pH 6.8; 5 מ’ גליצרול; מרחביות 3.7% (p/v); 0.6 מטר β-mercaptoethanol או 9 מ מ DTT; bromophenol 0.04% (v/v) כחול (BB)). 6. חלבון החילוץ הערה: חלבון החילוץ בוצע כפי שתואר לעיל20,23. לבצע שכל האזור הזה של ההליך ב 4 º C. תשאף המדיום תרבות לחלוטין. שטיפת 3 x 10 מ עם פוספט כקרח buffered תמיסת מלח (PBS) לכל 150 ס”מ2 היטב כדי למנוע ניתוק התא. כדי להשיג את התא lysate, להוסיף 3 מ”ל של פירוק מאגר לכל 150 ס מ2 , ביסודיות לגרד את פני השטח באמצעות המגרד של התא. הטיית הצלחת/שתייה צידניות כדי כ-45 מעלות יקל לאסוף את lysates תא לתוך הצינורות המתאימים שלהם. יוצקים 1 מ”ל של הטלפון הסלולרי lysate למחזור שלושה צינורות 1.5 mL. צינורות אלה יסומנו עם התנאי, של שכפול כפי שמצוין בשלב 3.1. 7. נפתחים Centrifuge צינורות 1.5 mL ב 11,000 x g 10 דקות ב 4 º C. להעביר את supernatants צינורות חדשים (א). קח את aliquot של זו תגובת שיקוע לכל תנאי צינורות שונים (B), דהיינו 50 µL למחזור. להוסיף מאגר x Laemmli 4 (16.6 µL עבור 50 µL של lysate) ומקפיאים ב-20 ° C. Lysates אלה ישמש כרגיל תספיג דגימות. Homogenize היטב את NeutrAvidin Agarose על ידי טלטול עדין. חותכים את הקצוות של הקצוות פיפטה כדי להגדיל את הקוטר שלהם ולשפר את pipetting של החרוזים.להוסיף 50 µL של NeutrAvidin Agarose לכל מיליליטר תא lysate את החצוצרות שלה (א). דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין מאוד כדי לאפשר NeutrAvidin לקיים אינטראקציה עם BCPPs קשור זוגם תאיים. צנטריפוגה ב 3000 x g עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את המתחם של NeutrAvidin עם חלבונים. בזהירות להסיר את supernatants ומעבירים אותם אל צינורות נקיים (C). למנוע מהם להשתמש בהם במקרה נפתחים אינו מוצלח. שטיפת מדרגות: להוסיף מאגר פירוק טריים כדורי (צינורות A), resuspend על-ידי היפוך, חזור על השלבים 7.6) ו- 7.7) עבור 5 פעמים יותר. כל supernatants האלה יכולים להיות מושלך. להסיר את supernatants ומוסיפים 2 x Laemmli מאגר האחסון הסופי הרצוי (40 µL למחזור 1.5 mL עבור כדורי המתקבל 150 ס”מ2 בקבוקונים של תאים confluent). Elute ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מביצועם של אינטראקציות בין חלבונים צנטריפוגה ב-30 s ב x 8,200 g כדי הצניפה NeutrAvidin חרוזים. קח את supernatants, המכיל את החלבונים dissociated, עם טיפים נימי צינורות חדשים (D). ניתן לשמור את החרוזים למקרה לחזור על השלבים • תנאי נדרש.הערה: supernatants (צינורות D) אתה מוכן להיות טעון ב תספיג או להקפיא ב-20 ° C. 8. תספיג חלבון הערה: סופג המערבית בוצעה כפי שתואר לעיל24. לטעון את נפח המקבילה של כל מדגם לכל ליין ב- Bis-טריס (4-12%) midigels מערכת אלקטרופורזה Midi-Cell. חלבונים Transblot באמצעות מערכת blotting יבש לתוך ערימה ניטרוצלולוזה רגיל. כתם הקרום עם 10% צבע מאכל פונסו למשך 10 דקות. לשטוף את הקרומים 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS. לחסום את הקרומים עם חלב 7% ב- TTBS עבור 1 h עם טלטול עדין צינורות או קופסאות קטנות. ודא שאמצעי האחסון המשמש מספיק כדי לכסות את הקרומים כי הם לא לייבש, כלומר 40 מ”ל לכל midi כל ממברנה. רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS. דגירה בין לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני נגד החלבון עניין ברעידות עדין. רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS. דגירה הקרום בטמפרטורת החדר עם כתב מצומדת peroxidase משני הנוגדן ב- TTBS לשעה. רחץ 3 x 5 דקות עם 5 מ של TTBS. לפתח עם מצע chemiluminescent במערכת chemiluminescence. 9. ופתרון בעיות. אם לאחר פיתוח המערב למחוק כל הדגימות הראה שאין אותות בכלל עבור חלבונים, בדוק את צבע מאכל פונסו.הערה: הקרום, צבע מאכל פונסו צריך להראות לא מוגדר ונטענת להקות רבות לאורך המסלולים. אם הרצועות אינן מורגש מאוד, בכמות החלבונים טעון לא בטוח שיהיה מספיק או אולי נעלם העברה שגוי. שקול חוזר את תספיג חלבון. אם הכתם אין בכלל בתוך הקרומית צבע מאכל פונסו במסלול כלשהו, חזור על כל התהליך מהשלב 7.4 את החצוצרות שלה (C). אם לאחר לפתח את תספיג חלבון אות חלש מאוד, אך צבע מאכל פונסו הראה חלבונים, תקופת דגירה שוב הקרום עם נוגדן ראשוני של זמן רב יותר. אם האות עדיין די חלשה, דגירה שוב בטמפרטורת החדר. 10. אחרים בשימוש בטכניקות במאמר זה Immunocytochemistry של BCPPs לתקן תאים paraformaldehyde 4% (0.2 מ”ל לכל ס מ2) במשך 20 דקות. רחץ 3 x 5 דקות עם PBS (0.2 מ”ל לכל ס מ2). להחיל את הנוגדן המתאים (לפחות 0.15 מ”ל לכל ס מ2) מדולל בפתרון נוגדן-ריכוז המצוין של היצרן נגד חלבון שלך עניין בן לילה ב 4 º C. דגירה עם fluorophore מצומדת משני נוגדנים (0.15 מ”ל לכל ס מ2) עבור 2 h בטמפרטורת החדר. חזור על צעדים 10.1.2-10.1.4 עם אחרים נוגדנים נגד החלבונים את עניין. יש להיזהר שלא להשתמש מאותו זן שונה נוגדנים הראשי או fluorophores באותו אורך גל של נוגדנים משניים. הר התאים באמצעות הכימית antifade (0.005 מ”ל לכל ס מ2). לנתח על מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחובר מצלמה דיגיטלית. MTT assay התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס. ובכן 24 צלחות. דגירה התאים בחושך למשך 75 דקות 0.15 מ של תרבות בינוני לכל ס מ2 המכילה 0.5 מ”ג/מ”ל MTT. האחות של המדיום, דגירה התאים 10 דקות בחושך עם דימתיל סולפוקסיד (0.25 mL לכל ס מ2) ברעידות מתון. למדוד את ספיגת באורך-גל של 570 nm באמצעות קורא microplate.